過濾柱的實驗裝置步驟

❶ 液相氣相色譜的操作步驟

氣相色譜操作規程及注意事項：
1.氣相色譜儀簡單操作流程
1.1 反時針方向開啟載氣鋼瓶閥門，減壓閥上高壓壓力表指示出高壓鋼瓶內貯氣壓力。
1.2.順時針方向旋轉減壓調節螺桿，使低鋒陵壓壓力表指示到要求的壓力數。
1.3開啟主機電源總開關，主機的觸摸式熒光屏顯示儀器正在自檢，柱室內鼓風馬達運轉。
1.4打開與氣相色譜儀連接的電腦，並運行氣相色譜儀工作軟體，待軟體與儀器連接成功後，即可進行實驗。
1.5在氣相色譜儀工作軟體里分別設定載氣流量、檢測器溫度、進樣口的溫度，柱箱的初始溫度及升溫程序等。設定完後，各區溫度開始朝設定值上升，當溫度達到設定值時，READY燈亮。
1.6查看儀器基線是否平穩，待基線平直後，即可進樣測試。
1.7實驗完畢後，先關閉檢測器電源，再停止加熱，待色譜柱、進樣口的溫度降至80℃以下時，依次關閉色譜儀電源開關，計算機電源，最後關閉載氣減壓閥及總閥。
1.8登記儀器使用情況，做好實驗室的整理和清潔工作，並檢查好安全後，方可離開
2 測試條件的設定：
色譜條件的設定要根據不同化合物的不同性質選擇柱子，一般情況極性化合物選擇極性柱。非極性化合物選擇非極性柱。色譜柱柱溫的確定主要由樣品的復雜程度決定。對於混合物一般採用程序升溫法。柱溫的設定要同時兼顧高低沸點或溶點化合物.可根據不同的化合物任意改動，其目的要達到在最短的時間里，使每個化合物的組份完全分離。
3 注意事項：
3.1操作過程中，一定要先通載氣再加熱，以防損壞檢測器。
3.2在使用微量進樣器取樣時要注意不可將進樣器的針芯完全拔出，以防壞進樣器。
3.3檢測器溫度不能低於進樣口溫度，否則會污染檢測器 進樣口溫度應高於柱溫的最高值，同時化合物在此溫度下不分解
3.4含酸、鹼、鹽、水、金屬離子的化合物不能分析,要經過處理方可進行。
3.5進樣器所取樣品要避免帶有氣泡以保證進樣重現性。
3.6取樣前用溶劑反復洗針，再用要分析的樣品至少洗2-5次
液相色譜操作規程及注意事項：
一、打開電腦
二、打開主機、預熱
三、進入儀器工作站，聯機並設定儀器使用方法及銀拆戚儀器參數
四、啟動泵的動力系統預處理（排氣等）
五、檢查是否漏夜、柱壓是否正常
六、設置儀器方法，包括儀器的使用條件等
七、激活操作方法，等待儀器平衡、基線平御激直
八、儀器出現「Ready」後可進行樣品分析
九、操作測試結束後，清理所有實驗材料，做好清潔衛生
十、記錄儀器使用日誌，並與管理員辦理交接手續
注意事項
一、高效液相色譜的流動相應採用色譜純溶劑，以滿足儀器要求、避免損壞色譜柱；
二、嚴禁使用有污染的水等沖洗色譜柱，避免將互不相溶的溶劑一同進入泵內；
三、流動相需經過濾、除氣後方可使用；
四、待分析的樣品必須徹底溶解澄清、過濾，以避免堵塞、損壞色譜柱；
五、分析完成後，須注意及時清洗色譜柱和檢測器的比色池。
以具體儀器的舉例：

島津LC-10AD型高效液相色譜儀操作規程

1．目的

規范島津LC-10AD型高效液相色譜儀的使用。

2．范圍

適用於島津LC-10AD型高效液相色譜儀的使用。

3．職責

質檢員對本規程的實施負責。

4．規程

4.1 系統組成

本系統由1個LC-10ADvp溶劑輸送泵、FCV-10AL低壓梯度混合器、在線脫氣機、Rheodyne 7725i手動進樣閥、SPD-10Avp紫外-可見檢測器、N2000色譜數據工作站和電腦等組成，另外還包括列印機、不間斷電源等輔助設備。

4.2 准備

4.2.1 准備所需的流動相，用合適的0.45μm濾膜過濾，超聲脫氣20min。

4.2.2 根據待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱（注意方向）和定量環。

4.2.3 配製樣品和標准溶液（也可在平衡系統時配製），用合適的0.45μm濾膜過濾。

4.2.4 檢查儀器各部件的電源線、數據線和輸液管道是否連接正常。

4.3 開機

接通電源，依次打開FCV-10AL低壓梯度混合器、脫氣機、LC-10ADVP輸液泵、AT-130柱溫箱，SPD-10Avp紫外檢測器，待檢測器自檢結束顯示測量狀態時，打開列印機、電腦顯示器、主機，最後打開色譜工作站。

4.4 參數設定

4.4.1 波長設定：在檢測器顯示初始屏幕時，按[func]鍵，用數字鍵輸入所需波長值，按[Enter]鍵確認。按[CE]鍵退出到初始屏幕。

4.4.2 流速設定：在輸送泵顯示初始屏幕時，按[func]鍵，用數字鍵輸入所需的流速（柱在線時流速一般不超過1ml/min），按[Enter]鍵確認。按[CE]鍵退出。

4.4.3 流動相比例設定：在輸送泵顯示初始屏幕時，按[conc]鍵，用數字鍵輸入流動相B的濃度百分數，用數字鍵輸入流動相C的濃度百分數，用數字鍵輸入流動相D的濃度百分數，按[Enter]鍵確認。按[CE]鍵退出。

4.5 更換流動相並排氣泡

4.5.1將管路的吸濾器放入裝有準備好的流動相的儲液瓶中；

4.5.2 逆時針轉動泵的排液閥180°，打開排液閥；

4.5.3 按輸送泵的[purge]鍵，pump指示燈亮，泵大約以5.0ml/min的流速沖洗，3min後停止；

4.5.4 將排液閥順時針旋轉到底，關閉排液閥。

4.5.5 如管路中仍有氣泡，則重復以上操作直至氣泡排盡。

4.5.6 如按以上方法不能排盡氣泡，從柱入口處拆下連接管，放入廢液瓶中，設流速為5ml/min，按[pump]鍵，沖洗3min後再按[pump]鍵停泵，重新接上柱並將流速重設為規定值

4.6 平衡系統

4.6.1 按《N2000色譜數據工作站操作規程》打開「在線色譜工作站」軟體，輸入實驗信息並設定各項方法參數後，按下「數據收集」頁的[查看基線] 按鈕。

4.6.2洗脫方式

4.6.2.1 按泵的[pump]鍵， pump指示燈亮。用檢驗方法規定的流動相沖洗系統，一般最少需6倍柱體積的流動相。

4.6.2.2 檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應予以排除。

4.6.2.3 觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動應不超過1MPa。如超過則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按4.5.6操作。

4.6.2.4 觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移<0.01mV/min，雜訊為<0.001mV時，可認為系統已達到平衡狀態，可以進樣。

4.7 進樣

4.7.1 進樣前按檢測器[zero]鍵調零，按軟體中 [零點校正] 按鈕校正基線零點，再按一下 [查看基線] 按鈕使其彈起。

4.7.2 用試樣溶液清洗注射器，並排除氣泡後抽取適量。

簡單故障排除
障常發生於泵和紫外檢測器。

一、泵的故障及排除方法

1、泵壓力變化較大或沒有流動相流出，又無壓力指示

（1）原因是泵內有大量氣體。可打開排放閥，使泵在較大流量下運轉，將氣泡排盡；也可以用一個50ml
針筒在泵出口處幫助抽出氣體。

（2）原因是高壓密封環變形，產生漏液。必須更換密封環；平時注意不要超出規定的最高壓力。

2、泵流量或壓力不穩

（1）原因是砂濾棒內有氣泡或被鹽的微晶粒或溢生的微生物部分堵塞。可卸下砂濾棒浸入10%硝酸內超
聲除去微生物或鹽溶解，或浸入流動相內超聲除氣泡。再用蒸餾水立即清洗。

（2）原因是系統內有氣泡。可加大流量排出氣泡。

（3）原因是單向閥有異物。可卸下單向閥，放入燒杯中，加10%稀硝酸，用超聲波清洗20分鍾後，再用
干凈蒸餾水清洗。

3、泵壓力過高

原因是管路被堵塞，需要卸下管道清除和清洗；壓力過低的原因是管路滴漏，可扳緊各介面和更換損壞
的管道。

4、鍵開關按下，泵不運行，只有嗡嗡電流聲

此故障原因是電機缺相，電機線圈被燒壞一組或活塞被生銹卡住，應視情況給予排除。

二、SPD-10A紫外檢測器的故障及排除方法

1、系統內有氣泡

（1）如果氣泡連續不斷地通過流動池，將使雜訊增大。必須對流動相進行充分除氣。

檢查系統各條導管是否漏氣。如果導管損壞，必須更換並固緊各介面，加大系統流量驅除氣泡。有條件
的葯廠可配備一部脫氣機。

（2）如果氣泡流在檢測器的流動池內，也可使噪音增大。

用手指壓緊流動池出口，使池內增壓，再快速放出流動相。反復操作數次，但注意不要使壓力增加太大
，以免流動池破裂或色譜柱沖壞。

2、流動相被污染

當流動池被污染時，可能產生噪音或基線漂移。可用水或甲醇等溶劑沖洗檢測池（要注意溶劑的互溶性
）。如果污染嚴重，就需要依次使用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或取出池體清洗，更換窗口。

3、光源燈出現故障

當氘燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產生嚴重噪音，基線漂移，出現平頭峰或齒形等異常峰，
甚至基線不能回零。這時必須更換氘燈（一般氘燈壽命1000～2000小時）。

4、倒峰

（1）倒峰的出現，可能是檢測器的極性接反。更正後即可將其轉復為正峰。

（2）如果流動相中含有紫外吸收的雜質時，無吸收的組分就會產生倒峰。對此，改為高純度的溶劑為流
動相。

（3）在死時間附近的尖銳峰，往往是由進樣時的壓力變化或者由於樣品溶劑與流動相不同所引起的

❷ 色譜柱的安裝步驟是什麼

1、保證輔助氣和檢測器用氣暢通，有效檢查氣體過濾器和進樣墊。需要將進樣口襯管清洗或更換，如果以前做過較臟樣品或活性較高化合物。

2、將螺母和密封墊裝在色譜柱上，並將色譜柱兩端，小心地切片不要有。

3、色譜柱連接於進樣口時色譜柱在進樣口中插入深度要根據所用儀器規格不同而定，有些需要距離較長，有些只要短距離即可，插入正確合適才能最大程度保證實驗結果正確性。

4、將色譜柱連接在檢測器上時應該注意色譜柱與進樣口連接要大致相同。

5、一流的色譜柱安裝前先確定載氣流量，只有通入載氣再對色譜柱進行加熱才會損壞設備。

6、色譜柱安裝與系統撿漏工作完成後就可以對其進行老化，將它升至一定恆溫，但不能超過溫度上限，達到老化溫度後記錄並觀察基線，初始時應當呈持續上升趨勢，到達老化溫度後開始下降並持續一段時間，然後到達固定值後就會穩定下來。

7、設置確認適合的載氣流速。載氣種類首選高純度氮氣或者氫氣，越能夠延長色譜柱壽命，並在很大程度上降低背景噪音。

對熱銷的色譜柱進行正確安裝後，便可以放心開始混合物分離實驗。在使用過程中還要注意色譜柱有沒有出現異常現象需要維護，比如可以通過實驗後得到的色譜圖觀察圖像是否正常，色譜柱性能是否有出現下降，然後便可以對症下葯處理相應問題。

❸ 過濾操作的詳細過程

過濾操作要求「一貼、二低、三靠」。

一貼

即使濾紙潤濕，緊貼漏斗內壁，不殘留氣泡。（防止氣泡減慢過濾速度。）

二低

1、濾紙邊緣略低於漏斗邊緣。

2、液面低於濾紙邊緣。（防止液體過濾不凈。）

三靠

1、傾倒時燒杯杯口要緊靠玻璃棒上。

2、玻璃棒下端抵靠在三層濾紙處。

3、漏斗下端長的那側管口緊靠燒杯內壁。

(3)過濾柱的實驗裝置步驟擴展閱讀：

注意事項

1、燒杯中的混合物在過濾前應用玻璃棒攪拌，然後進行過濾。

2、過濾後若溶液還顯渾濁，應再過濾一次，直到溶液變得透明為止。

3、過濾器中的沉澱的洗滌方法：用燒瓶或滴管向過濾器中加蒸餾水，使水面蓋沒沉澱物，待溶液全部濾出後，重復2~3次。

4、斗架燒杯玻璃棒，濾紙漏斗角一樣：「斗」指漏斗；「架」指漏斗架。這兩句點明了過濾操作實驗所需要的儀器：漏斗、漏斗架、燒杯、玻璃棒、濾紙，並且強調濾紙折疊的角度要與漏斗的角度一樣。

5、過濾之前要靜置：意思是說在過濾之前須將液體靜置一會兒，使固體和液體充分分離。

6、三靠兩低不要忘：意思是說在過濾時不要忘記了三靠兩低。「三靠」的意思是指漏斗頸的末端要靠在承接濾液的燒杯壁上，要使玻璃棒的底端靠在濾紙上，盛過濾液的燒杯嘴要靠在玻璃棒上；「兩低」的意思是說濾紙邊緣應略低於漏斗的邊緣，所倒入的濾液的液面應略低於濾紙的邊緣。

❹ 血紅蛋白凝膠過濾層析所需儀器、用具、物品和實驗的具體方案

一、實驗目的

1.了解凝膠柱層析的原理及應用；

2.掌握凝膠柱層析的基本操作技術，為進一步掌握離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等其它分離方法打下良好的基礎。

二、實驗原理

凝膠層析：原理與應用

凝膠層析又稱凝凝膠過濾，是一種按分子量大小分離物質的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然後用緩沖液洗脫。大分子無法進入凝膠顆粒中的靜止相中，只能存在於凝膠顆粒之間的流動相中，因而以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，並很快在流動相和靜止相之間形成動態平衡，因此就要花費較長的時間流經柱床，從而使不同大小的分子得以分離。

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凝膠過濾柱層析所用的基質是具有立體網狀結構、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質。這種物質可以完全或部分排阻某些大分子化合物於篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數Kav（被分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關，即：

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恆定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值小；反之，則Kav值增大。因此，在同一凝膠柱上分離分子量不同的物質時，由於流動相的作用，這些分離物質將發生排阻和擴散效應。若緩沖液連續地傾入柱中，柱中物質的排阻和擴散效應也將連續地發生，其最終結果是分子量大的物質先從柱中流出，分子量小的物質則後從柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等時地收集起來，檢測後分段合並相同組分的各管流出物，即等於把分子量不同的物質相互分離開了。其分離效果受操作條件（如基質的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等）的影響，而最直接的影響是Kav值的差異性，Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，則分離效果很差，或根本不能分開。

分配系數Kav既是判斷分離效果的一個參數，又是測定蛋白質分子量的一個依據。從公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要測出床體積Vt 和外水體積Vo 以及洗脫體積Ve，即可計算出Kav值。而凝膠床總體積Vt可用測量法得到：

由凝膠床的組成可知，床體積Vt等於外水體積Vo、內水體積Vi與凝膠顆粒實際佔有體積Vg之和。即

Vt = Vo+Vi+Vg = Vo+Vi

而Vo和Vi可通過實驗測得：當把分子量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在內水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大於凝膠孔徑上限者不能進入凝膠網孔內，而被排阻在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積Ve剛好等於外水體積。即Ve=Vo (Kav=0)。然而，溶液中的分子小於凝膠孔徑下限者能自由進入凝膠網孔內，凝膠床的洗脫體積Ve應等於凝膠床總體積，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。而溶液中的分子大小介於凝膠孔徑上限和下限之間者，則能進入部分凝膠網孔中，故其洗脫體積Ve是在Vo和Vt之間（Kav在0－1之間）。

以床體積Vt（等於pr2h）和測得值Vo來計算分配系數的值為Kav，若以床體積Vt（等於Vo+Vi）和測得值Vo來計算分配系數的值為Kd。在同一層析條件下，對同一物質計算出來的Kav和Kd值盡管有一定的差異性，但都是有效的。只因Kav計算方便，所以目前多使用Kav。分離物在凝膠過濾層析時的行為，除用Kav和Kd表示外，還可用Ve/Vo或Vo/Ve（R值）表示。

反應原理

凝膠過濾不僅常用做物質的分離，還可以根據需要用某種試劑非常方便地處理某種物質，當該物質流經試劑區時，因為可連續接觸新鮮試劑，因而可以充分發生反應，最後經過洗脫，再與過量的試劑分開。本實驗就是通過凝膠過濾，用還原劑FeSO4處理血紅蛋白。即首先在層析柱中加入含有還原劑的溶液，使形成一個還原區帶，當血紅蛋白樣品（血紅蛋白與鐵氰化鉀的混合液）流經還原區帶時，褐色的高鐵血紅蛋白立即生成紫色的還原型血紅蛋白，隨著還原型血紅蛋白繼續下移，與緩沖液中的氧分子結合又形成了鮮紅的血紅蛋白。鐵氰化鉀則因分子量小，在層析柱中呈現其本來的黃色帶而遠遠地落在血紅蛋白的後邊。本實驗操作簡便，直觀性強，趣味性濃，通過肉眼觀察即可檢驗分離效果。

三、實驗材料

1.器材：層析柱，?10×200

2.試劑：

(1) 20mM磷酸二氫鈉

(2) 20mM磷酸氫二鈉

(3) 40mM FeSO4(用時現配)

(4) 0.2M Na2HPO4，80mM Na2H2EDTA

(5) 抗凝血（哺乳動物血樣，以1：X的比例加入%檸檬酸鈉，置於4℃冰箱中保存。貯存期以不超過3個月為宜）

(6) Sephadex G-25

(7) 固體鐵氰化鉀

四、儀器設備

鐵架台、恆流泵

五、實驗步驟

1．凝膠的處理 取3克葡聚糖凝膠（Sephadex-25）乾粉，浸泡於蒸餾水中充分溶脹（室溫，6小時），然後傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，最後加入等體積pH7磷酸緩沖液繼續浸泡（磷酸緩沖液用試劑1、2以39:51的比例混合，並用pH計校對）。

2．裝柱 將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約5-7cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊到入柱中，同時開啟止水螺絲，控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。最好一次連續裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現界面。裝柱長度至少8cm。最後放入略小於層析柱內徑的濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。

3．平衡 用磷酸緩沖液洗脫，平衡20分鍾。注意液面不要低於凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。

4．血紅蛋白樣品的制備 取1ml抗凝血於燒杯中，加入10ml pH7 20mM磷酸緩沖液，再加入固體鐵氰化鉀，使濃度達到5mg/ml。

5．層析柱還原層的形成 取1ml 40mMFeSO4於小燒杯中，加入1ml 0.2M Na2HPO4,80mM Na2H2EDTA混合液攪拌均勻。待層析柱上緩沖液幾乎全部進入凝膠時，速取該混合液0.4ml加入層析柱中，待混合液完全進入柱床後加入0.7ml緩沖液。（注意還原劑的混合液要新鮮配製，盡可能縮短在空氣中暴露的時間）。

6．上樣 將柱中多餘的液體從底部流出後關閉止水螺絲,取前面制備好的血紅蛋白樣品0.5ml，將樣品溶液小心加到凝膠柱上，打開止水螺絲，使樣品溶液流入柱內。

7．洗脫 用緩沖液進行洗脫，控制緩沖液在約每5秒一滴的流速，觀察並記錄實驗現象。

8．清洗 待所有色帶流出層析柱後，加快流速，繼續清洗層析柱5min