畫出實驗室聚合反應裝置圖

A. 如何製作安全漂亮的實驗裝置

安全漂亮化學實驗：

1、鐵棒與硫酸銅

原理：將除銹處理後的鐵棒放入硫酸銅溶液中，鐵單質比銅更加活潑，置換出來的銅形成漂亮的鬆散沉澱。

溶液原本是藍色的（水合銅離子顏色），隨著反應進行，藍色逐漸變淡。

銅離子本身並沒有藍色，無水硫酸銅是白色粉末。水溶液中藍色的是六水合銅離子。

2、暗之柱

原理：黑咖啡可不會變成這東西。杯中是對硝基苯胺和濃硫酸的混合物，加熱後發生非常復雜的反應——事實上，我們還不完全清楚反應的詳細過程。最後得到的黑色泡沫物原子比例為C6H3N1.5S0.15O1.3，幾乎肯定是對硝基苯胺交聯後的多聚物。整個反應有時被稱為「爆炸式聚合」。膨脹成這么大這么長是反應生成二氧化碳等氣體的功勞。

這個反應是70年代NASA研究者發現的，他們當時考慮過把它用作滅火劑——因為生成的黑色泡沫狀物非常穩定，隔熱性能也極好。

3、鋅火

原理：這種液體是二乙基鋅。它是一種極易燃燒的有機鋅化合物，接觸氧氣便自燃。真正的二乙基鋅如此圖所示是藍色火焰，但是網上流傳最廣的視頻/動圖來自2008年諾丁漢大學，他們拍到了黃色的火焰——照他們自己的說法，這是鈉污染所致。

二乙基鋅於1848年發現，是第一個有機鋅化合物。它在有機合成中的應用極其廣泛，也曾被早期火箭研究者用作液體燃料。

4、滴水生火

過氧化鈉和水反應產生氧氣並放出大量的熱，使白磷著火生成大量的五氧化二磷白煙。

操作：在600毫升燒杯的底部鋪一層細砂，砂上放一個蒸發皿。取2克過氧化鈉放在蒸發皿內，再用鑷子夾取2塊黃豆大小的白磷，用濾紙吸去水分後放在過氧化鈉上。用滴管向過氧化鈉滴1～2滴水，白磷便立即燃燒起來，產生濃濃的白煙．

5、液中星火

高錳酸鉀和濃硫酸接觸會產生氧化性很強的七氧化二錳，同時放出熱量。七氧化二錳分解出氧氣，使液中的酒精燃燒。但由於氧氣的量較少，只能發出點點火花，而不能使酒精連續燃燒。

操作：取一個大試管，向試管里注入5毫升酒精，再沿著試管壁慢慢地加入5毫升濃硫酸，不要振盪試管。把試管垂直固定在鐵架台上。這時，試管里的液體分為兩層，上層為酒精，下層為濃硫酸。用葯匙取一些高錳酸鉀晶體，慢慢撒入試管，晶體漸漸落到兩液交界處。不久，在交界處就會發出閃閃的火花。如果在黑暗的地方進行，火花就顯得格外明亮。

注意事項：高錳酸鉀的用量不可過多，否則，反應太劇烈，試管里的液體會沖出來。

6、冰塊著火

水和鉀反應劇烈，使生成的氫氣燃燒。氫氣的燃燒使電石和水反應生成的乙炔著火。燃燒所產生的熱進一步使冰融化成水，水和電石作用不斷地產生乙炔，因此火焰就越燒越旺，直到電石消耗完，火焰才漸漸熄滅。

操作：取一大塊冰放在大瓷盤里，在冰上挖一個淺坑，放入一小塊電石和一小塊鉀。然後向淺坑裡滴幾滴水，立即冒出一團烈火和濃煙，好像冰塊著火似的。

B. 聚合酶鏈反應的反應體系

PCR基本原理示意圖（如右圖）：
在一個典型的PCR反應體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2 和兩個合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min，引物與模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循環前模板預變性3～5min；在末次循環後，樣品仍需繼續延伸3～5min以上，確保擴增的DNA為雙鏈DNA。為便於了解PCR反應中各成份的組成，加入量和反應條件，使人們以此為基礎，對不同的研究對象逐項改變來找到最佳反應條件，特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應條件供參考。 用於PCR的標准緩沖液見PCR操作範例。於72℃時，反應體系的pH值將下降1個單位，接近於7.2。二價陽離子的存在至關重要，影響PCR的特異性和產量。實驗表明，Mg2 優於Mn2 ，而Ca2 無任何作用。
1．Mg2 濃度Mg2 的最佳濃度為1.5mmol/L（當各種dNTP濃度為200mmol/L時），但並非對任何一種模板與引物的結合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結合時，都要把Mg2 濃度調到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg2 過量易生成非特異性擴增產物，Mg2 不足易使產量降低。
樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負電荷的離子基團如磷酸根，會與Mg2 結合而降低Mg2 有效濃度。因此，用作模板的DNA應溶於10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。
dNTP含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg2 的有效濃度。標准反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低於1.5mmol/L的Mg2 濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時，必須相應調整Mg2 的濃度。
2．Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時，在典型的熱循環條件下，真正的pH值在7.8～6.8之間。
3．KCl濃度K 濃度在50mmol/L 時能促進引物退火。但研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時，KCl濃度高於50mmol/L將會抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl對PCR結果沒有太大影響。
4．明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩定酶的作用。一般用量為100μg/ml，但現在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR結果，影響不大。
5．二甲基亞碸（DMSO）在使用Klenow片段進行PCR時DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利於減少DNA的二級結構，使（G C）%含量高的模板易於完全變性，在反應體系中加入DMSO使PCR產物直接測序更易進行，但超過10%時會抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多數並不使用DMSO。 在PCR反體系中dNTP終濃度高於50mmol/L會抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入，高濃度dNTPs易產生錯誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應物的產量。PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低於10～15μmol/L。四種dNTP的濃度應相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導聚合酶的錯誤摻入，降低合成速度，過早終止反應。
決定最低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成，例如，在100μl反應體系中，4×dNTPs濃度若用20μmol/L，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μgDNA，而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
購自廠商的dNTP溶液一般均未調pH，應用1mol/l NaOH將dNTP貯存液pH調至7.0，以保證反應的pH值不低於7.1。市購的游離核苷酸凍乾粉，溶解後要用NaOH中和，再用紫外分光光度計定量。 典型PCR反應混合物中，所用酶濃度為2.5U/μl，常用范圍為1～4U/100μl。由於DNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，多聚酶的用量亦有差異，酶量過多會導致非特異產物的增加。
由於生產廠家所用兵配方、製造條件以及活性定義不同，不同廠商供應的TaqDNA聚合酶性能也有所不同。
Cetus公司酶定義是：1個酶單位是指在以下分析條件下，於74℃，30min內使10nmmol的dNTP摻入酸不溶性成分所需的酶。測定時間為10min，折算成30min摻入量。
分析條件為25nmol/L TAPS（三羥基-甲基-氨基丙烷磺酸鈉pH9.3.25℃），50mmol/l KCl，2mmol/L MgCl2.1mmol/L β-ME（巰基乙醇），dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP為100mmol/L(由不標記及α-32P標記混合)，12.μg變性鯡魚精子DNA，最終體積50μl。 單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得到第一條cDNA。雖然PCR可以僅用極微量的樣品，甚至是來自單一細胞的DNA，但為了保證反應的特異性，還應用ng級的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白。
DNA的大小並不是關鍵的因素，但當使用極高分子量的DNA（如基因組的DNA時），如用超聲處理或用切點罕見的限制酶（如Sal1和Not1）先行消化，則擴增效果更好。閉環靶序列DNA的擴增效率略低於線狀DNA，因此，用質粒作反應模板時最好先將其線狀化。
模板靶序列的濃度因情況而異，往往非實驗人員所控制，實驗可按已知靶序列量逆減的方式（1ng，0.1ng，0.001ng等），設置一組對照反應，以檢測擴增反應的靈敏度是否符合要求。 在實際工作中常採用瓊脂糖凝膠電泳。一般情況下先在電泳緩沖液或凝膠中加1%溴化乙錠（EB）（每100ml加100μl），然後將已經制備好的1%～2%瓊脂糖凝膠（用電泳緩沖液配製）放入電泳槽內，加入待測樣品10μl，同時用分子量標准品作標記。瓊脂糖濃度應按分離DNA片段的大小進行選擇，一般用1.5%～2%，電泳電壓75V，待樣品進行凝膠內距膠末端1cm時，切斷電源，取出凝膠在紫外燈下直接觀察結果。
由於溴化乙錠可與雙鏈DNA形成結合物，在紫外燈下能發射熒光，使EB的熒光強度增強80～100倍，所以，電泳後凝膠在紫外燈下可直接觀察。一般肉眼觀察DNA量可達10ng，其熒光強度與DNA含量成正比。
DNA分子在凝膠中泳動速度決定於電荷效應及分子效應。前者由所帶凈電荷量決定，而後者與分子大小及構型有關。按照DNA分子大小，其凝膠濃度可做不同的調整。有條件的實驗室也可用聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）分析擴增的DNA片段。 PCR技術必須有人工合成的合理引物和提取的樣品DNA，然後才進行自動熱循環，最後進行產物鑒定與分析。引物設計與合成目前只能在少數技術力量較強的研究院、所進行，臨床應用只需購買PCR檢測試劑盒就可開展工作，PCR自動熱循環中影響因素很多，對不同的DNA樣品，PCR反應中各種成份加入量和溫度循環參數均不一致。現將幾種主要影響因素介紹如下。
一、溫度循環參數
在PCR自動熱循環中，最關鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作範例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個循環，擴增片段500bp。在這里，每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度後開始計算。在自動熱循環儀內由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決於幾個因素，包括反應管類型、壁厚、反應混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差，在設置熱循環時應充分給以重視和考慮，對每一儀器均應進行實測。
關於熱循環時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應時間是按最適於合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。
1．模板變性溫度變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復性，因而減少產量。一般取90～95℃。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶後最高變性溫度不宜超過95℃。
2．引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降；溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。一般先由37℃反應條件開始，設置一系列對照反應，以確定某一特定反應的最適退火溫度。也可根據引物的（G C）%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度比擴增引物的融解溫度TTm低5℃，可按公式進行計算：
Ta = Tm -5℃= 4(G C) 2(A T)-5℃
其中A，T，G，C分別表示相應鹼基的個數。例如，20個鹼基的引物，如果（G C）%含量為50%時，則Ta的起點可設在55℃。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L）,退火反應數秒即可完成，長時間退火沒有必要。
3．引物延伸溫度溫度的選擇取決於Taq DNA聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃，在72℃時酶催化核苷酸的標准速率可達35～100個核苷酸/秒。每分鍾可延伸1kb的長度，其速度取決於緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質。擴增片段如短於150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對於100～300bp之間的短序列片段，採用快速、簡便的雙溫循環是行之有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。對於1kb以上的DNA片段，可根據片段長度將延伸時間控制在1～7min，與此同時，在PCR緩沖液中需加入明膠或BSA試劑，使Taq DNA聚合酶在長時間內保持良好的活性與穩定性；15%～20%的甘油有助於擴增2.5kb左右或較長DNA片段。
4．循環次數常規PCR一般為25～40個周期。一般的錯誤是循環次數過多，非特異性背景嚴重，復雜度增加。當然循環反應的次數太少，則產率偏低。所以，在保證產物得率前提下，應盡量減少循環次數。
擴增結束後，樣品冷卻並置4℃保存。
二、引物引物設計
要擴增模板DNA，首先要設計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5』端決定擴增產物的兩個5』末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結果的關鍵，引物設計也就更為重要。
引物設計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個鹼基，可以用DNA合成儀合成與其對應互補的二條引物，除此之外，引物設計一般遵循的原則包括：
1．引物長度根據統計學計算，長約17個鹼基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少於16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為20～24個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應溫度（通過72℃）下不會形成穩定的雜合體。有時可在5』端添加不與模板互補的序列，如限制性酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5』端生物素標記或熒游標記可用於微生物檢測等各種目的。有時引物不起作用，理由不明，可移動位置來解決。
2．（G C）%含量引物的組成應均勻，盡量避免含有相同的鹼基多聚體。兩個引物中（G C）%含量應盡量相似，在已知擴增片段（G C）%含量時宜接近於待擴增片段，一般以40%～60%為佳。
3．引物內部應避免內部形成明顯的次級結構，尤其是發夾結構（hairpinstructures）。例如：
4．引物之間兩個引物之間不應發生互補，特別是在引物3』端，即使無法避免，其3』端互補鹼基也不應大於2個鹼基，否則易生成「引物二聚體」或「引物二倍體」（Primer dimer）。所謂引物二聚體實質上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產品，有時甚至成為主要產物。
另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續6個以上相同鹼基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待擴增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上鹼基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。
5．引物3』端配對DNA聚合酶是在引物3』端添加單核苷酸，所以，引物3』端5～6個鹼基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴格，這樣才能保證PCR有效擴增。
引物設計是否合理可用PCRDESN軟體和美國PRIMER軟體進行計算機檢索來核定。
人工合成的寡核苷酸引於最好經過色譜（層析）純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質。純化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生長；一般情況下，不用的引物應保存在-20℃冰箱中，在液體中引物能保存6個月，凍干後可保存1～2年。
三、DNA聚合酶
在1956年Kornberg等就從大腸桿菌提取液中發現了DNA聚合酶，並且得到了DNA聚合酶Ⅰ純品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量為109000的一條多肽鏈構成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解為兩個片段，一個片段分子量為76000，有聚合酶活性，並有3』→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一個片段分子量為34000，具有5』→』3』外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個加到3-OH末端。二是有』3』→5』外切酶活力，能識別和消除錯配的引物末端，與復制過程中校正功能有關。三是5』→3』外切酶活力，它能從5』端水解核苷酸，還能經過幾個核苷酸起作用，切除錯配的核苷酸。1985年Mullis 等發明了PCR方法，以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR後，世界上許多實驗室就考慮用耐熱DNA聚合酶代替Klenow片段進行PCR，使耐熱多聚酶的研究得以迅速發展。人們從生活於60℃（B.Stearothermophilus）到87℃（S.Solfatavicus）的許多菌中分離純化出耐熱DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA變性所需溫度，所以無法應用於PCR。
1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及應用的關鍵。Klenow片段不能耐受95℃的雙鏈DNA變性溫度，所以每次循環都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高溫，避免了不斷補加多聚酶的繁瑣操作，同時使退火和延伸溫度得以提高，減少了非特異性產物和DNA二級結構對PCR的干擾，增進了PCR特異性、產量和敏感度，二者相比，其主要區別在於：①Klenow酶的最適溫度為37℃，擴增的產物並非全是目的序列，需用探針檢測。Taq酶則不僅產率高而特異性也高。它的最適溫度為74～75℃。因而使退火溫度可以提高，使退火嚴格性提高，減少錯配引物的延伸。②循環後期酶量漸感不足而產生平坡。到達平玻的循環次數，Klenow酶為20個（均用1μg基因組DNA開始）而Taq酶為30個。③延伸片段長度Taq酶為10kb以內，而Klenow酶為400bp以內。
Taq酶由水棲高溫菌（Thermusaquatics）YT1蓖株中分離而得。此菌於1969年由Brock分離自美國黃石公園溫泉，作為棲熱桿菌的標准菌株，其生長溫度為70～75℃。最初從中分離到分子量60～68KDa，比活性為2000～8000U/mg的DNA聚合酶。後來Cetus公司的Kary Mullis等又分離到比活為20萬U/mg的純酶，分子量為93910。此種9.4KDa酶的最適溫度為75～80℃，與單純核苷酸的結合率（Kcat）可達150核苷酸（nt）/s酶分子。以M13模板，用富含G C的30bp引物延伸，70℃時Kact>60nt/s；55℃可達24nt/s；37℃時為1.5nt/s，而22℃時低至0.25nt/s。高於90℃時DNA合成活性甚差，這種高溫條件下，引物與模板已不能牢固結合。
在PCR反應混合液中，Taq酶於92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的時間分別為130、40及5～6min，在50次循環的PCR中當管內最高溫度為95℃。每循環為20s時尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半壽期為40min，故在PCR循環中選用的變性溫度，不宜高於95℃。
Taq酶現已可用基因重組的方法生產，商品名為Ampli Taq（Cetus公司）。Taq酶的完整基因長2499bp，在大腸桿菌中表達生產，含832個氨基酸。在氨基酸序列上與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括對dNTP結合，引物與模板作用區均存在於Taq酶中。
Taq酶具有依賴DNA合成的5』→』3』外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3』-磷酸化的「阻斷物」，會被逐個切除而不會阻止來自上游引物鏈的延伸，而對於5』-32P標記的合成寡核苷酸引物，則無論是單鏈或是與模板復性，都未發現降解，所以該種活性不會影響PCR結果。Taq酶沒有3』→』5』外切酶活性，如果發生dNTP錯誤摻入，這種酶沒有校正能力，因此運用Taq酶進行PCR，產物中點突變較多，對克隆等不太有利。一般錯摻率為1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs濃度分別為200μmol/L，Mg2 為1.5mmol/L，在55℃退火)。但不含3』→5』外切酶活性對測序有利。
2．影響酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2 離子的影響。用鯡精DNA為模板，總dNTP濃度0.7～0.8mmol/L,Mg2 為2.0mmol/L時激活能力最高。濃度超過此值產生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力達40%～50%。dNTP能與Mg2 結合，故游離Mg2 只是結合後剩餘的量。若總dNTP濃度高至4～6mmol/L時，Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。
dNTP濃度低時PCR產率及特異性均增高，適合於用擴增摻入法標記生物素及放射性元素。當100μlPCR液中含dNTP各40μmol/L時就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）。
用鯡精DNA，70℃，10min內dNTP的摻入量計算，標准條件為100%。
純9.4KDa Taq酶不含3』→5』核酸外切酶活力。誤摻入率取決於dNTP濃度。但Taq酶具有DNA依賴的鏈移位5』→3』核酸外切酶活力。對5』→3』32P標記寡核苷酸單鏈，或與MB模板雜交時均只有極少的降解力。
中等濃度KCl能刺激Taq酶合成活力達50%～60%，最佳KCl濃度為50mmol/L，濃度更高有抑製作用，>200mmol/L的KCl可使酶失活。
加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl,可產生中度抑制或無作用。
低濃度尿素、DMSO、DMF或甲醯胺影響不大，吐溫20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%）的抑製作用。
3．第二代耐熱DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel將TaqDNA聚合酶的5』→3』外切酶活性片段（N端289個氨基酸）去除，稱為stoffel片段。其97.5℃的半衰期從Taq DNA聚合酶的5～6min提高到20min，同時該酶片段也對兩個或更多模板位點的擴增反應即復合PCR（Multiplex PCR）更為有利。
VentTMDNA多聚酶：是美國New England Biolabs公司從潛水艇排氣孔（Vent）中分離的超級嗜熱菌-能生長於98℃中的Thermococcus litoralis中分離純化得到的，故名Vent酶。它的一些酶學性質較Taq DNA聚合酶更為優越，它能耐100℃高溫且2h以上仍有活力，並且具有3』→5』外切酶活性的校正能力，錯誤擴增的機率比Taq酶降低一倍。後來該公司又從深水潛艇（2010m）排氣孔分離的能在104℃生長的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表達的Deep Vent DNA聚合酶，在95℃的半壽期達23h（Vent酶為6.7h,Taq酶為1h）。
4．RTth逆轉錄酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆轉錄-PCR（RT-PCR）的發展很快，所以對耐熱的依賴於RNA的DNA多聚酶的研究也有進展。有實驗表明Taq DNA多聚酶有依賴於RNA的DNA聚合酶活性，但活性較弱。Cetus公司於1991年推出一種rTth Reverse Tran－scriptase,有很好的依賴於RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴於DNA的耐熱DNA聚合酶活性，二種活性分別依賴於Mn2 Mg2 ，這樣就可分別控制酶活性。利用該酶只需250ng的總RNA即可有效地進行RT-PCR，得到特異的DNA片段，從而非常有利於逆轉錄PCR的發展。
耐熱DNA聚合酶的研究得到長足的發展，這在PCR發展中起到了重要的作用。相信隨著進一步的研究，將使人們對耐熱DNA聚合酶的認識和應用更進一步地發展。
我國的PCR研究發展很快，其關鍵試劑-耐熱DNA聚合酶-也已有幾個實驗室能夠分離純化，如復旦大學遺傳學研究所、華美公司、中國醫學科學院基礎醫學研究所。後二者的菌株為Thermus aquaticus YT-1。前者則是從自己篩選的嗜熱菌中分離純化，復旦大學遺傳所亦已成功地克隆了該聚合酶的基因並獲得了耐熱F4DNA聚合酶，其酶學性質非常接近於Taq DNA聚合酶，為中國PCR的開展提供了保證。
四、影響PCR特異性的因素
通過上述內容。可以看出有許多因素可以影響PCR的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考：①退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。②減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發及錯誤延伸。③引物二聚體是最常見的副產品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發，尤其是引物的二聚化。④改變MgCl2(有時KCl)濃度可以改進特異性，這可能是提高反應嚴格性或者對Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次級結構，例如待擴增的片段易自行形成發夾結構時，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2』-脫氧鳥苷-5』-三磷酸（7-deaza-2』-deoxyguanosine-5』-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150μmol/l de7GTP 50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，則可阻非特異性產物的生成。
五、擴增平坡
擴增反應並不是可以無窮地進行下去的，經過一定的循環周期後需擴增的片段不再按指數增多而逐漸進入平坡；進入平坡的循環次數，取決於起始時存在的模板拷貝數以及合成的DNA總量。所謂平坡就是批PCR循環的後期，合成產物達0.3～1pmol時，由於產物的堆積，使原來以指數增加的速率變成平坦的曲線。造成PCR進入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完畢、Taq酶失活，這幾中因素在標准反應中均不會出現。此外，還有幾種可能：
1．底物過剩因DNA合成量多於反應液中存在的Taq酶，在100μl反應液中含2.5Utaq酶而DNA合成量達1μg（3nmol脫氧核苷酸）時，開始變為底物過剩。延長延伸時間或添加Taq酶，可以克服之。但不實用，因每進行下一循環就要延長延伸時間一倍及多加一倍Taq酶，才能繼續保持指數增長。
2．非特異性擴增產物的競爭與上述情況密切相關，此時不需要的DNA片段與需要的片段同時競爭聚合酶，要克服這一情況是要提高反應特異性，使不需要片段不能大量積聚。
3．退火時產物的單鏈自己締合兩條單鏈的DNA片段在退火時除了與引物締合外，也可以自行締合，這也會阻止產品增多。當產物濃度到達10pmol/100μl時即可發生此現象，除稀釋外無法克服。
4．變性在高濃度產物條件下，產物解鏈不完全，以及最終產物的阻化作用（焦磷酸化，雙鏈DNA）。
總而言之，PCR的條件是隨系統的而異的，並無統一的最佳條件，先選用通用的條件擴增，然後稍稍改變各參數，可以達到優化，以取得優良的特異性和產率。

C. 聚合酶鏈式反應的原理

聚合酶鏈式反應之所以靈敏度比較高，就是因為聚合酶鏈式反應原理，目前聚合酶鏈式反應可以檢測DNA的情況，對於生物學領域來說，聚合酶鏈式反應有很大的幫助，接下來我們來具體了解一下聚合酶鏈式反應的原理有哪些吧。

聚合酶鏈式反應的原理及功能

聚合酶鏈式反應已經相對成熟了，那麼聚合酶鏈式反應的原理及功能是什麼呢？

聚合酶鏈式反應是在試管中進行DNA復制反應，基本原理與體內相似，不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加熱(變性)、冷卻(退火、保溫(延伸)等改變溫度的辦法使DNA得以復制，反復進行變性、退火、延伸循環，就可使DNA無限擴增。

聚合酶鏈式反應能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，並能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，聚合酶鏈式反應技術一經問世就被迅速而廣泛地用於分子生物學的各個領域。通常需要檢查的人群為疑似某種特定的疾病病人，進行分子特異性檢查。

聚合酶鏈式反應的原理和過程

聚合酶鏈式反應一般要在實驗室進行，那麼聚合酶鏈式反應的原理和過程什麼呢？

聚合酶鏈式反應就是將聚合酶鏈式反應反應體系升溫至95℃左右，雙鏈的DNA模板就解開成兩條單鏈，此過程為變性。然後將溫度降至引物的Km值以下，3端與5端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補區域結合，此過程稱為退火。當將反應體系的溫度升至70℃左右時，耐熱的Taq DNA聚合酶催化四種脫氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互補方式依次加至引物的3端，形成新生的DNA鏈。每一次循環使反應體系中的DNA分子數增加約一倍。

聚合酶鏈式反應理論上循環幾次，就增加為2^n倍。當經30次循環後，DNA產量達2^30拷貝，約為10^9個拷貝。聚合酶鏈式反應擴增過程見圖8-1。由於實際上擴增效率達不到2倍，因而應為(1+R)^n，R為擴增效率。

聚合酶鏈式反應的原理及技術

聚合酶鏈式反應這項技術已經相對完善，那麼聚合酶鏈式反應的原理及技術怎麼樣呢？

聚合酶鏈式反應的原理就是DNA的半保留復制。聚合酶鏈式反應反應中變性這一步很重要，若不能使模板DNA和聚合酶鏈式反應產物完全變性，聚合酶鏈式反應反應就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的變性溫度愈高。太高的變性溫度和時間又會影響Taq酶的活性，通常的變性溫度和時間分別為95℃、30s，有時用97℃、15s。

雖然DNA鏈在變性溫度時兩鏈分離只需幾秒鍾，但反應管內部達到所需溫度還需要一定的時間，團此要適當延長時間。為了保證模板DNA能徹底變性.最好為7-10min，然後在以後的循環中，將變性步驟設為95℃/min。

聚合酶鏈式反應的原理是什麼

聚合酶鏈式反應靈敏度是比較高的，那麼聚合酶鏈式反應的原理是什麼呢？

聚合酶鏈式反應的原理是雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子拷貝。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發現對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。

聚合酶鏈式反應的延伸溫度一般為72℃左右，此時Taq酶活性為每秒鍾摻入核苷酸35-100個，2kb的片段用1min已足夠，若DNA片段較長，擴增時間可適當延長。聚合酶鏈式反應延伸時間過長又可引起非特異性擴增。