⑴ HPLC法測定蜂膠中黃酮類化合物的含量,給個方法謝了！
1 儀器與材料
蜂膠由上海舜夏生物科技有限公司提供,主要來自河南、浙江和福建。槲皮素對照品(自製,經高效液相色譜分析,純度≥98%),乙腈、甲醇均為色譜純(Sigma公司) ,水為超純水,其餘試劑為分析純。島津LC-10ATvp 液相色譜儀(包括LC-10AT 色譜泵、SPD - 10Avp 紫外檢測器、混合器、Class-vp 色譜工作站) ;超純水制備儀(PALL公司) ;電子分析天平(METTLER AE200) 。
2 方法
2. 1 色譜條件
色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6mm×150 mm,3.5μm);流動相A:乙腈-甲醇(9∶1) ,流動相B: 20 mmol/L的醋酸銨溶液(用醋酸調pH至3.5),梯度洗脫,流速0.8mL/min,檢測波長360nm ,柱溫30℃。梯度程序為:0～10min ,從13%A 線性梯度至17%A ;10～50min,線性梯度至70%A;50～60min,線性梯度至100%A。每次運行結束後以初始流動相平衡色譜柱20min,以保證出峰情況穩定。
2. 2 溶液的制備
供試品溶液的制備:精密稱取蜂膠0.5g ,置25mL小燒杯中,分別用15mL 甲醇超聲2次(每次30min),過濾,殘渣用甲醇洗滌2次,過濾,合並濾液,置50mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。對照品溶液的制備:精確稱取槲皮素10 mg ,置50mL量瓶中,加甲醇使之溶解並稀釋至刻度,配成0.2mg/mL的溶液。
2. 3 方法學考察
為了考察分析方法的可靠性,以槲皮素的峰為內參比峰,其色譜峰(s)的保留時間和峰面積為l,計算其他各峰的相對保留時間和相對峰面積比值。
2. 3. 1 精密度試驗取同一份供試品溶液,連續進樣5次,檢測指紋圖譜,考察各主要色譜峰與內參比峰相對保留時間和相對峰面積的一致性,結果表明各主要色譜峰保留時間的RSD 均在1.0%以內,相對峰面積的RSD均在1. 5 %以內。
2. 3. 2 穩定性試驗取同一份供試品溶液,分別在0 ,4 ,8 ,12 ,24h 進行檢測。結果表明,各主要色譜峰相對保留時間無明顯變化,RSD 均在1.4%以內;相對峰面積也變異較小,RSD 均在2%以內。
2. 3. 3 重復性試驗取同一批號的供試品5份,按供試品溶液的制備方法,分別製成供試品溶液進行分析。結果表明,各主要色譜峰相對保留時間較穩定,相對保留時間的RSD 均在1. 1 %以內;相對峰面積也變異較小,RSD 均在2.5%以內。
3 結果
3. 1 測定方法
分別精密量取對照品溶液和各供試品溶液10μL ,注入液相色譜儀,記錄50 min 圖譜即得。以槲皮素的色譜峰(s) 的保留時間和峰面積為1,計算其他各峰的相對保留時間和相對峰面積比值。
3. 2 不同來源蜂膠指紋圖譜比較
按供試品溶液的制備方法操作,分別取各批葯材製成供試品溶液,取10μL 進樣。同前條件測定圖譜,見圖3。對不同產地的蜂膠指紋圖譜比較選出10 穩定的且具有代表的峰作為共有峰,見圖1。各樣品的指紋圖譜較為相似,但各共有蜂面積的比值有明顯不同。
4 討論與結論
4. 1 本研究採用RP-HPLC 梯度洗脫的方法對蜂膠總黃酮進行研究,參考了相關文獻的色譜條件,對其黃酮成分的分離取得了良好的效果。在對7批不同來源的蜂膠葯材進行色譜分析的基礎上建立了蜂膠的指紋圖譜。
4. 2 蜂膠中黃酮類化合物主要包括黃烷酮、黃酮醇類、雙氫黃酮類,世界各地蜂膠樣品中分離出來的黃酮類化合物已有70多種。其中黃烷酮主要有白楊素、楊芽黃素、芹菜素、刺槐素、木犀草素、柳穿魚素、蜜橘黃素、福橘黃素等;黃酮醇類主要包括槲皮素、蘆丁、山柰素、鼠李素、良姜素、高良姜素等;雙氫黃酮類主要有喬松素、櫻花素、柚皮素等。本實驗採用甲醇超聲溶解能夠較好地提取黃酮類成分,絕數色譜峰的紫外吸收均顯示為黃酮類成分的特徵吸收,與文獻報道的色譜圖基本相似,10個共有峰相對保留時間符合程度較好,所測圖譜能夠反映出蜂膠的指紋特徵。
4. 3 不同產地的蜂膠指紋圖譜有明顯不同,峰數與相對峰面積相差較大,提示蜂膠用保健品應在固定產地的前提下,才能保證品質的一致性。
4. 4 蜂膠是含有樹脂狀物的粘性物質,不溶於水,易溶於甲醇、乙醇和甘油等有機溶劑。經過反復篩選本文選定溶解性高、無干擾的甲醇為溶劑。為克服蜂膠的黏性、樣品處理時需冷凍粉碎;在用甲醇溶解提取後,需要過濾,除去不溶性雜質。