Ⅰ 干貨分享 | 活性氧ROS的流式檢測
活性氧（ROS）的流式檢測通常採用熒光探針DCFH-DA，其原理在於DCFH-DA進入細胞後被酯酶水解為DCFH，隨後在細胞內ROS作用下氧化生成發熒光的DCF，熒光強度與ROS水平正相關。通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡檢測，激發波長為480nm，發射波長為525nm。
選擇熒光探針時，DCFH-DA是常用選項，其工作原理為：無熒光的DCFH可自由穿過細胞膜，一旦進入細胞，被酯酶水解成DCFH，隨後在細胞內的ROS作用下氧化生成DCF，具有熒光。熒光強度與ROS水平成正比。
熒光探針DCFH-DA的裝載分為原位裝載和收集細胞後裝載兩種方式。對於刺激時間較短（通常為2小時以內）的細胞，推薦先裝載探針，後用活性氧陽性對照或葯物刺激細胞。對於細胞刺激時間較長（通常為6小時以上）的細胞，先用活性氧陽性對照或葯物刺激細胞，後裝載探針。
原位裝載探針適用於貼壁培養細胞。按照1:1000稀釋DCFH-DA至10微摩爾/升，去除細胞培養液，加入適當體積的DCFH-DA，充分蓋住細胞，通常不少於1毫升。37℃細胞培養箱內孵育20分鍾後，用無血清細胞培養液洗滌細胞三次。在刺激細胞20-30分鍾後，活性氧陽性對照可顯著提高活性氧水平。
收集細胞後裝載探針方法適用於懸浮細胞。按照1:1000稀釋DCFH-DA至10微摩爾/升，細胞收集後懸浮於稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升。37℃細胞培養箱內孵育20分鍾，每隔3-5分鍾顛倒混勻，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養液洗滌細胞三次。在刺激細胞20-30分鍾後，活性氧陽性對照可顯著提高活性氧水平。
檢測步驟包括激光共聚焦顯微鏡觀察或熒光分光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀檢測。使用488nm激發波長，525nm發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前後熒光強度變化。DCF的熒光光譜與FITC相似，可用FITC參數設置檢測DCF。
流式方法檢測需提供實驗細胞和刺激葯物。流程為細胞培養、加葯刺激、細胞標記、流式上機檢測、結果分析。結果包括流式原始數據、數據分析結果和實驗報告，內容涉及儀器、試劑及實驗步驟。