1. 什么是中压柱色谱
将分析色谱的进样量增大，同时得出大量的所需物质（馏分）的过程就可以称为制备色谱。版分析色谱权的目的，是分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量。制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。而制备色谱系统则是利用制备色谱的思想高效能得到纯化物质的多个分析测试设备联用的总称。
传统的制备色谱一般由一台可以连续输送液体的恒流泵、紫外检测仪与色谱柱构成，部件是价格不一，款式多样的色谱柱，这也是影响最终制备效果的关键性环节。柱子有多种类型，不仅材质不一，填料也有很多学问
2. 是谁制造出第一台色谱仪
色谱法,又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。它的英文名称为：chromatography这个词来源于希腊字 chroma和 graphein，直译成英文时为 color和writing两个字;直译成中文为色谱法。但也有人意译为色层法或层析法。
右图为高中生物学实验中的叶绿体色素纸层析分离实验，就是一种简单常见的色谱分析方法（纸色谱）。
1906年由 Tswett 研究植物色素分离，提出色谱法概念；他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。按光谱的命名方式，这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。
在色谱法中，静止不动的一相（固体或液体）称为固定相（stationary phase） ；运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相（mobile phase）。
柱色谱（Column chromatography)为向玻璃管中填入固定相，以流动相溶剂浸润后在上方倒入待分离的溶液，再滴加流动相，因为待分离物质对固定相的吸附力不同，吸附力大的固着不动或移动缓慢，吸附力小的被流动相溶剂洗下来随流动相向下流动，从而实现分离。
纸色谱 (Paper chromatography)以滤纸条为固定相，在纸条上点上待分离的混合溶液的样点，将纸条下端浸入流动相溶剂中悬挂，溶剂因为毛细作用沿滤纸条上升，样点中的溶质从而被分离。 （图片就是纸色谱法。）
薄层色谱(Thin-layer chromatography)是在玻璃板上涂以固定相涂层，然后点样，下端浸入溶剂，同样自下而上分离。常用于探索柱色谱实验条件，溶剂和固定相的选择等。
常用固定相有石膏、氧化铝、蔗糖、淀粉等，常用流动相为水、苯等各种有机溶剂。
色谱法的分类方法很多，最粗的分类是根据流动相的状态将色谱法分成四大类。
色谱法按流动相种类的分类：
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│ 色谱类型 │ 流动相 │ 主要分析对象 │
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│气相色谱法 │ 气体 │ 挥发性有机物 │
│液相色谱法 │ 液体 │可以溶于水或有机溶剂的各种物质│
│超临界流体色谱法│ 超临界流体 │ 各种有机化合物 │
│电色谱法 │缓冲溶液、电场│ 离子和各种有机化合物 │
└————————┴———————┴———————————————┘
色谱仪chromatograph
为进行色谱分离分析用的装置。包括进样系统、检测系统、记录和数据处理系统、温控系统以及流动相控制系统等。现代的色谱仪具有稳定性、灵敏性、多用性和自动化程度高等特点。有气相色谱仪、液相色谱仪和凝胶色谱仪等。这些色谱仪广泛地用于化学产品，高分子材料的某种含量的分析，凝胶色谱还可以测定高分子材料的分子量及其分布。
例：
MC029-GC102气相色谱仪
该产品为实验室用的填充相气相色谱仪，具有热道、氢焰二种检测器，定温控制恒温槽及气流控制装置。可广泛应用于石油、化工、医学及厂矿科研单位作为生产控制、科学研究方面的有机、无机气体和沸点400℃以内的液体样品进行常量、微量分析。
特点：
□石油炼制工业及其特种油类的制造过程的控制和质量检验。
□人造纤维及合成树脂等对其原料体、中间体聚合过程中的控制或质量检验。
□农业的化肥、农药的分析及合成过程中原料体、中间体的控制或质量检验。
□医药卫生方面的制药、劳动防护、有毒气体的分析分离等。
□生物化学方面的生物液体分离分析研究等。
技术指标：
□检测器灵敏度：热导池：S≥1000mVml/mg；载气H样品C6H6；氢焰：Mt≤1?0－10g/sec；载气N2样品C6H6
□检测器稳定性：基线漂移：≤0.05mV/h
□层析柱恒温室：（室温＋40℃－300℃）；恒温精度：?.3℃；有效区最大温差：2℃； 气化室：最高400℃
3. 高效液相色谱有几大模块各有什么作用
仪器是这样的：
泵：负责输送流动相，并且推动整个系统的进行。就像是仪器的心脏专一样。现在的色谱泵还属有多通道，可以调节比例，或者跑梯度。
进样装置：当然是负责进样了。自动进样装置可以根据设置来选择注入多少量的样品，比如1-100ul应该都可以。
色谱柱和柱温箱：色谱柱是实验人员自己连接的，主要是为了分离样品。它就像是一个长长的跑道，让各个选手拉开距离。柱温箱就是为了保证色谱柱的温度，更好的分离样品。
检测器：在色谱柱当中分离开来的组分流入检测器，然后形成一个一个的色谱峰。然后变成数据传导到工作站上面。
工作站，如果你是安捷伦的工作站，那么在线模块就特别清晰地一一对应各个仪器模块了。
4. 实验室检测设备有哪些
普通的：pH计、烘箱、天平、恒温水浴锅、油浴锅、电热板、分光光度计、离回心机、凯氏定氮答仪、火焰光度计、流动分析仪。各种玻璃管、各种玻璃瓶、各种塑料管、各种塑料瓶、铝盒、封口袋、称量纸、pH试纸、剪刀、胶、笔、登记本等等；高端一点的：原子吸收光谱仪，TOC仪、元素分析仪、原子发射光谱仪、离子色谱仪、气相色谱仪、液相色谱仪、同位素质谱仪等等。
5. 安捷伦气相色谱柱怎么安装的，能帮我安装下吗
气相色谱柱只有正确的安装才能保证发挥其最佳的性能和延长使用寿命。安装过程如下：
1.检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等，检查气体过滤器和进样垫，保证辅助气和检测器的用气畅通有效。如果以前做过较脏样品或活性较高的化合物，需要将进样口的衬管清洗或更换。
2.将螺母和密封垫装在色谱柱上，并将色谱柱两端要小心切平。
3.将色谱柱连接于进样口上。色谱柱在进样口中插入深度根据所使用的GC仪器不同而定。正确合适的插入能最大可能地保证试验结果的重现性。通常来说，色谱柱的入口应保持在进样口的中下部，当进样针穿过隔垫完全插入进样口后如果针尖与色谱柱入口相差1-2cm，这就是较为理想的状态。将色谱柱正确插入进样口后，用手把连接螺母拧上，拧紧后（用手拧不动了）用扳手再多拧1/4-1/2圈，保证安装的密封程度。
4.当色谱柱与进样口接好后，通载气。将色谱柱的出口端插入装有己烷的样品瓶中，正常情况下，我们可以看见瓶中稳定持续的气泡。如果没有气泡，就要重新检查一下载气装置和流量控制器等是否正确设置，并检查一下整个气路有无泄漏。等所有问题解决后，将色谱柱出口从瓶中取出，保证柱端口无溶剂残留，再进行下一步的安装。
5.将色谱柱出口端连接于检测器上。其安装和所需注意的事项与色谱柱与进样口连接大致相同。如果在应用中系统所使用的是ECD或NPD等，那么在老化色谱柱时，应该将柱子与检测器断开，这样检测器可能会更快达到稳定。
6.通载气，再对色谱柱的安装进行检查。注意：如果不通入载气就对色谱柱进行加热，会快速且永久性的损坏色谱柱。
7.色谱柱的老化。色谱柱安装和系统检漏工作完成后，就可以对色谱柱进行老化了。
对色谱柱升至一恒定温度，可加热至高于最高使用温度10-20℃左右，但是一定不能超过色谱柱的温度上限，那样极易损坏色谱柱。当到达老化温度后，记录并观察基线。初始阶段基线应持续上升，在到达老化温度后5-10分钟开始下降，并且会持续30-90分钟。当到达一个固定的值后就会稳定下来。如果在2-3小时后基线仍无法稳定或在15-20分钟后仍无明显的下降趋势，那么有可能系统装置有泄漏或者污染。遇到这样的情况，应立即将柱温降到40℃以下，尽快的检查系统并解决相关的问题。如果还是继续的老化，不仅对色谱柱有损坏而且始终得不到正常稳定的基线。
一般来说，涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间长，而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。当柱子分离过含有高水分样品后，需要将色谱柱重新老化，以除去固定相中吸附的水分。
8.柱流失检测。在色谱柱老化过程结束后，利用程序升温作一次空白试验（不进样）。一般是以10℃/min从50℃升至最高使用温度，达到最高使用温度后保持10min。这样我们就会的到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和实验问题的解决有帮助。（比如：如果在正常的使用状态下，基线的信号值增高，那么可能色谱柱的性能开始下降。另外，如果在很低的温度下，基线信号值明显的大于初始值，那么有可能是色谱柱和GC系统有污染。）
6. 什么是热水浸提法实验室操作.实验装置是什么样的
多糖（polysacharides,PS）,又称多聚糖,是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的,具有广泛生物活性的天然大分子化合物.它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内.20世纪60年代以来,人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂,具有免疫调节功能,能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病,甚至能抗AIDS病毒[2].如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10],黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5].(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用.如柴胡多糖具有抗辐射,增强免疫功能等生物学作用[6],麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8],动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9].(3)多糖能控制细胞分裂和分化,调节细胞的生长与衰老.如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10],银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]. 另外,多糖作为药物,其毒性极小,因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣. 由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关,而多糖的结构又是相当复杂的,所以在这一领域的研究相对缓慢.但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作. 1. 多糖的提取[12] 1.1 热水浸提法： 1.1.1多糖提取条件的优选根据文献报道[13]：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等.在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选,才能选出最佳提取方案. 1.1.2其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥首先除去表面脂肪.原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液,水浴加热搅拌或回流1－3小时,脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖.温度控制在90－100℃,搅拌4－6小时,反复提取2－3次.得到的多糖提取液大多较粘稠,可进行吸滤.也可用离心法将不溶性杂质除去,将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）.然后浓缩,再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等,与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀.然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤.将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时,可直接冷冻干燥）.干燥后可得粉末状的粗多糖. 1.2 微波辅助提取法：其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度,使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热,从而使萃取物质从基体或体系中分离出来,进入到介电常数小,微波吸收能力较差的萃取剂中[14]. 由于微波能极大加速细胞壁的破裂,因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度,增加提取产率.而且由于其选择性好,提取后基体能保持良好的性状,提取液也较一般的提取方法澄清[15]. 聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较,发现微波辅助提取法所需时间最短（10min）,多糖的提取率最高（28.46％）. 1.3 超声辅助法：其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取,另外超声波的次级效应,如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合,利于提取[16]. 超声波辅助法与常规提取法相比,具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]. 1.4 索氏提取法：将植物粉末置于索氏提取器中,加入石油醚,60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）.过滤,滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇,再提取6小时,过滤,滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水.回流提取2次,趁热过滤,滤液减压浓缩,再除蛋白,醇沉,除色素.60℃干燥,称重. 1.5 醇提法：先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中,振荡充分再抽滤.滤液中加入足量无水乙醇,至于4℃冰箱中过夜.减压抽滤,再除去色素,得多糖粗品,在60℃通风干燥箱中干燥,再置干燥皿中恒重保存. 醇提法方法简单,易于操作,但提取率较低,乙醇使用量大,不宜大规模提取使用. 1.6 其它方法：多糖的提取方法还有稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等.但由于稀酸、稀碱条件下,易使多糖发生糖苷键的断裂,部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少,因而很多试验中避免采用稀碱液浸提法和稀酸液浸提法. 2. 多糖的纯化 2.1 多糖中杂质除去方法 粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质,必须分别除去. 2.1.1 除蛋白质采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖,常混有较多的蛋白质,脱去蛋白质的方法有多种：如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理,但用酸性试剂宜短,温度宜低,以免多糖降解.常用的方法有[19]： 2.1.1.1 沙维积法（Sevag法）[20]：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶与水的特点,将多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比调为25:5:1或25:4:1,混合物剧烈振摇20到30分钟,蛋白质与氯仿－戊醇（或正丁醇）生成凝胶物而分离,然后离心,分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质.此种方法较温和,在避免降解上有较好效果,但效率不高,如五味子多糖的提取实验中要重复处理达三十几次.并且每次除去蛋白质变性胶状物时,不可避免的溶有少量多糖,另外少量多糖与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白,在处理时会沉淀下来,造成多糖的损失.如能配合加入一些蛋白质水解酶,再用Sevage法效果更佳. 2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合,低温下搅拌10min左右,离心得上面水层,水层继续用上述方法处理几次,即得无蛋白质的多糖溶液,此法效率高,但溶剂沸点较低,易挥发,不宜大量应用. 2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸,直至溶液不再继续混浊为止,在5－10℃放置过夜,离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液.此法会引起某些多糖的降解. Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三种方法均不适合糖肽,因糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来.对于对碱稳定的糖蛋白,在硼氢化钾存在下,用稀碱温和处理,可以把这种结合蛋白质分开[1]. 2.1.1.4 酶解法[22]：在样品溶液中加入蛋白质水解酶,如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等,使样品中的蛋白质降解.通常将其与Sevag法综合使用除蛋白质效果较好. 2.1.1.5 盐酸法[23]：取样品浓缩液,用2mol/L盐酸调节其PH至3,放置过夜,在3000r/min条件下离心,弃去沉淀,即脱去蛋白质. 另有李知敏[23]和叶将瑜[25]等人分别在植物多糖实验中证明：盐酸法、三氯乙酸法及Sevag法脱蛋白率分别为72.5％、46.1％和42.3％,多糖的损失率分别为15.1%、6.1％和14.3％.盐酸法脱蛋白率高,但多糖的损失率也较高;三氯乙酸法较温和,但除蛋白效率不高；Sevag法的脱蛋白效果不及前两种. 2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba（OH）2溶液,振荡后离心去蛋白.此法除蛋白不够彻底,可结合Sevag法使用.还可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉淀完全,在4000r/min的条件下离心10min,收集上清液,即为除蛋白液.还有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白,将混合液清摇,再静置,取上清液.此过程需重复多次方可除尽蛋白. 除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验,观察在280mm处是否有吸收,如果无吸收则表明蛋白质已经除尽[24]. 2.1.2 除色素 2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素[12]：活性炭属于非极性吸附剂,有着较强的吸附能力,特别适合于水溶性物质的分离.它的来源充足,价格便宜,上柱量大,适用于大量制备性分离.目前用于色谱分离的活性炭主要分为粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭三种.一般情况下,尽量避免用活性炭处理,因为活性炭会吸附多糖,造成多糖的损失. 2.1.2.2对于植物来源的多糖,可能含有酚型化合物而颜色较深,这类色素大多呈负性离子,不能用活性炭吸收剂脱色,可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA－7来吸附色素. 2.1.2.3若糖和色素时结合的,易被DEAE纤维素吸附,不能被水洗脱,这类色素可进行氧化脱色：以浓氨水或NaOH液调至PH8.0左右,50℃以下滴加H2O2至浅黄色,保温2小时. 2.1.2.4 依次用丙酮、无水乙醚和无水乙醇洗涤多糖,即可得到较为纯净的多糖.此法较为简单,便于操作,多糖损失也较小. 2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素.操作简单,多糖有一定损失. 2.1.2.6发酵来源的多糖颜色一般较浅,色素含量较少,一般可不除色素. 2.1.2.7对于动物,微生物等提取得到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理. 2.1.3 除低聚糖等小分子杂质 2.1.3.1采用逆向流水透析法.即准备好一桶蒸馏水,用一根导管将水通入透析袋的烧杯底部,另用一根导管将水引出,根据水量控制流速,使水缓慢流动48小时.这样得到的就是多糖的半精品. 2.1.3.2利用溶液浓度扩散效应,将分子量小的物质如无机盐、低聚糖等从透析袋渗透到袋外的蒸馏水中,不断换水即可保持浓度差,从而除尽小分子杂质.具体的做法是根据多糖溶液的体积截取相应长度的透析袋,用透析夹夹住一端,灌入多糖液,离液面2－3cm处夹紧透析袋,置于一大烧杯中,注入蒸馏水至完全浸没透析袋后,用磁力搅拌器慢速搅拌,每12小时换一次水,重复3－4次. 2.2 多糖的纯化方法 纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程,纯化的方法主要有以下几种： 2.2.1 分部沉淀法 根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质,逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮,收集不同浓度下析出的沉淀,经反复溶解与沉淀后,直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）.这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖.为了多糖的稳定,常在pH7进行,唯酸性多糖在pH7时－COOH是以－COO` 离子形式存在的,需在pH2－4进行分离,为了防止苷键水解,操作宜迅速.此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等,然后将多糖衍生物溶于醇中,最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离. 2.2.2 盐析法 在天然产物的水提液中,加入无机盐,使其达到一定浓度或饱和,促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出,与其它水溶性较大的杂质分离.常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等. 2.2.3 季铵盐沉淀法 季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂,可与酸性糖形成不溶性沉淀,常用于酸性多糖的分离.通常季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀,但当溶液的PH增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高时,也会与中性多糖形成沉淀.常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氢氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide,CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride,CP－OH）.CTAB或CP－OH的浓度一般为1％－10％（W/V）的多糖溶液中,酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来,所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖.值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9,而且不能有硼砂存在,否则中性多糖将会被沉淀出来. 2.2.4 柱层析：包括纤维素柱层析、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析、高压液相层析和其它柱层析.如用活性炭及硅胶做载体的柱层来分离多糖；或用硼砂型的离子交换树脂分离中性多糖. 纤维素柱层析 纤维素柱层析对多糖的分离既有吸附色谱的性质,又具有分配色谱的性质,所用的洗脱剂是水和不同浓度乙醇的水溶液,流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱,水溶性差的最后出柱,与分级沉淀法正好相反. 纤维素阴离子交换柱层析 最常见的交换剂为DEAE－纤维素（硼酸型或碱型）,洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等.此方法目前最为常用.它一方面可纯化多糖,另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖. 凝胶柱层析 凝胶柱层析可将多糖按分子大小和形状不同分离开来,常用的凝胶有葡聚糖凝胶（sephadex G）、琼脂糖凝胶（sepharose bio－gel A）、聚丙烯酰胺凝胶（bio－gel P）等,常用的洗脱剂是各种浓度的盐溶液及缓冲液,但它们的离子强度最好不低于0.02.出柱的顺序是大分子的先出柱,小分子的后出柱.由于糖分子与凝胶间的相互作用,洗脱液的体积与蛋白质的分离有很大的差别.在多糖分离时,通常是用孔隙小的凝胶如sephadex G－25、G－50等先脱去多糖中的无机盐及小分子化合物,然后再用孔隙大的凝胶sephadex G－200等进行分离.凝胶柱层析法不适合于粘多糖的分离. 亲和层析 用凝聚素（一般是蛋白质和糖蛋白）做亲和色谱来分离多糖. 高压液相层析 2.2.5 制备性区域电泳 分子大小、形状及所负电荷不同的多糖其在电场的作用下迁移速率是不同的,故可用电泳的方法将不同的多糖分开,电泳常用的载体是玻璃粉.具体操作是用水将玻璃粉拌成胶状、柱状,用电泳缓冲液（如0.05mol/L硼砂水溶液,PH9.3）平衡3天,将多糖加于柱上端,接通电源,上端为正极（多糖的电泳方向是向负极的）,下端为负极,其单位厘米的电压为1.2－2V,电流30－35MA,电泳时间为5－12小时.电泳完毕后将玻璃粉载体推出柱外,分割后分别洗脱、检测.该方法分离效果较好,但只适合于实验室小规模使用,且电泳柱中必须有冷却夹层. 2.2.6 金属络合物法 常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等. 2.2.7 其它方法：纯化除采用上述方法外,还有超过滤法（多糖溶液通过各种已知的超过滤膜就能达到分离）、活性炭柱色谱.另据报道,国外多采用的LKB柱色谱系统,用比旋度、示差折射及紫外检测多糖,各组分的峰位自动记录,分离效果好且方便. 2.3 多糖纯度的鉴定 2.3.1超离心法 由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小和形状有关,故当将多糖溶液进行密度梯度超离心时,如果是组分均一的多糖,则应呈现单峰.具体的做法是将多糖样品用0.1molNaCl或0.1molTris盐缓冲溶液配制成1％－5％的溶液,然后进行密度超离心,待转速达到恒定后（通常是60000r/min）,采用间隔照明的方法检测其是否为单峰. 2.3.2高压电泳法 由于中性多糖导电性差、分子量大、在电场中的移动速度慢,故常将其制成硼酸络合物进行高压电泳.多糖的组成不同、分子量不同,其与硼酸形成的络合物就不同,在电场作用下的相对迁移率也会不同,故可用高压电泳的方法测定多糖的纯度.通常高压电泳所用的支持体是玻璃纤维纸、纯丝绸布、聚丙酰铵凝胶、纤维素醋酸酯薄膜等.缓冲液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液,电压强度约为30－50V/cm,时间是30－120min.由于电泳时会产生大量的热,所以要有冷却系统,将温度维持在0℃左右,否则会烧掉支持体.一般单糖、低聚糖因醛基而发生的颜色反应在多糖上不明显,电泳后常用的显色剂是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和过碘酸希夫试剂等. 2.3.3凝胶柱层析 常用的凝胶是Sephadex、Sepharose、Sephacryl,展开剂为0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶与0.02醋酸1：1的缓冲溶液,柱高和柱直径之比大于40. 2.3.4旋光测定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度为10％左右,离心得沉淀.上清液再加入乙醇使其浓度为20％－25％,离心所得二次沉淀,比较二次沉淀的比旋度.如果比旋度相同则为纯品,否则为混合物. 2.3.5其它方法：官能团摩尔比恒定法,即如为纯品两次分离所得产物的官能团如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩尔比应该恒定.类似的方法还有示查折射法、HPLC法等.此外德国常用高压液相法来检测多糖纯度,结果可靠. 必须注意的是：纯度检查一般要求有上述两种方法以上的结果才能肯定.