⑴ 除了硝酸银，还有什么试剂能检测氯离子
其实主要是ag+检测
以下引用论文
摩尔法测定氯离子
摩尔法测定氯离子的范围为=5~100 mg/L。周少玲等[2]从理论上指出以铬酸钾为指示剂，在中性或弱碱性条件下，用硝酸银标准溶液进行滴定实验，由于AgCl的沉淀溶解损失，溶液中仍然余留0.44 mg/L的氯离子不能被滴定。所以对于氯离子含量低的水质用摩尔法测定会造成较大的分析误差，而且测定精密度也较差。在用AgNO 3滴定氯离子的过程中，Ag+易与溶液中的氨形成银氨络离子Ag（NH 3）+，从而增加了AgNO 3的消耗量，造成分析结果偏高。所以，摩尔法测定中水中氯离子含量时，应控制溶液的pH值为中性。周强等[3]以耐盐性较强的大麦品种“鉴4”幼苗为材料，用硝酸银滴定法测定植物体内氯离子含量。结果得出在0~0.5 mol/L范围内的线性关系较好，相关系数r为0.9986，但标准曲线未通过坐标原点。回收率为87.73% ~117.78%，RSD为10.80%。准确度仅为88.43%，变
异系数为10.33%。
摩尔法是一种传统的测量方
法，但仅对氯离子含量高的物质
测定较准确，此方法采用的铬酸
钾和硝酸银试剂是有毒物质，且
排放到环境中会造成环境污染；
硝酸银试剂价格高，增加了测定
成本，影响了方法的实用性。
2.2
分光光度法
分光光度法是通过测定被测
物质在特定波长处或一定波长
范围内光的吸收度，对该物质进
行定性和定量分析的方法。
杨学芬[4]
研究了以过氧化氢
为氧化剂，硝酸-
甘油为介质，
分光光度法测定工业亚磷酸中
氯离子含量。此系统的稳定性
高，测定波长为380 nm，氯离子
含量在1~6 g/mL
范围内呈线性
关系，相关系数为0.9999，回收
率为96%~105%。
关瑞等[5]
通过研究氯化银沉
淀在明胶-
乙醇水溶液中的稳
定性，建立了测定微量氯离子的
分光光度分析方法，并应用到有
机工艺水中微量氯离子的测定。
在实验最佳条件下，氯离子浓度
在0~6 mg/L
范围内呈良好线性，
相关系数为0.9993，方法的标准
偏差为0.108，变异系数为
0.026，回收率为101%~105%。该
方法的检测限为1.35 ×10
- 2
mg/L。
顾立公[6]
利用在酸性条件下，
氯离子与硫氰酸汞反应生成微
电离的氯化汞络合物，释放出等
量的硫氰酸根与铁（III）反应生
成红色的络合物，建立了硫氰酸
汞-
硝酸铁间接分光光度法测
定水中的微量氯离子的方法，得
出氯离子含量在0.2~10 mg/L
范
围内呈良好线性关系，相关系数为
0.9992，回收率在95.8%~102.1%。
本方法灵敏度高，重现性好，方
法简便、
快速，可用于水中微量
氯离子的测定。
氯化物共沉淀富集分光光度
法是一种国标方法[7]
。该方法用
磷酸铅沉淀做载体，共沉淀富集
痕量氯化物，经离心机分离后，
用硝酸铁/
高氯酸溶液完全溶解
沉淀物，加硫氰酸汞/
甲醇溶液
显色，用分光光度计间接测定痕
量氯离子，测定范围为0.01~0.1
mg/L。
分光光度法可以精确测定微
量氯离子，灵敏度高，重现性好，
方法简便、
快速。但是共沉淀富
集分光光度法采用的磷酸铅、
硫
氰酸汞和甲醇试剂是有毒物质，
影响操作人员的健康，且这些试
剂使用量很大，如果不加处理直
接排放则会造成严重的环境污
染。
2.3
浊度法
此浊度法是在比色法的基础
上发展起来的，是根据测量光线
通过悬浮液后透射光的强度进
行分析的一种分析方法，在临床
分析、
食品分析、
环境分析、
工业
分析、
药物分析等研究工作中应
用广泛。
陈振华等[8]
研究了在表面活
性剂下用硝酸银浊度法测定Cl
-
。
结果表明，在0.3 mol/L
酸性条件
下，吐温- 60
作为AgCl
浊度的
稳定剂，该方法的线性范围为
0~8 g/mL，相关系数r =0.991，回
收率为87.75%~103.33%，可用
于发电厂炉水中Cl
-
的测定。
王爱荣等[9]
研究了以乙二醇
为增溶剂，硝酸银作沉淀剂，采
用氯化银比浊法，在不分离硫酸
铜的条件下，直接测定酸性镀铜
液中微量氯离子。测定波长为
440 nm，线性范围为0~2 g/mL，其
俞凌云，等：氯离子测定方法及其应用研究行业论坛
33
西部皮革第31
卷
表观摩尔吸光系数ε=113 ×
105，方法检出限为0.035 g/mL，
该法用于测定酸性镀铜液中微
量氯离子在不同水平的加标回
收率为95.4%~104.5%。杜斌等[10]
研究了以非离子型微乳液乳化
剂OP/
正丁醇/
正庚烷/
水为介
质，
AgCl
浊度法测定氯离子的试
验条件。该方法的线性范围为
0.2~3.4 mg/L，
r =0.9997，
RSD <
2.8%，回收率为94%~104%，可
用于水泥原料、
生料及熟料中微
量氯离子的测定。
申海燕[11]
利用氯化银沉淀在
明胶-
乙醇水溶液中的稳定性，
建立了一种测定有机工艺水中
微量氯离子的浊度法。该法的线
性范围为0~6 mg/L，
r =0.9993，回
收率为95.2%~101.3%。王兆喜
等[12]
设置流动注射分析仪器参数
工作波长为450 nm，进样频率为
60
次/h，建立了反相流动注射比
浊法测定水中的氯离子含量的
方法。 氯离子的浓度在1.0 ×
10
- 5
～10.0×10
- 4
mol/L
范围内与
吸光度呈良好线性关系，相关系
数为0.995，回收率为95%
~101%，
RSD<2.49%。
此浊度法操作简便、分析时
间短、
所用试剂少、
运行成本低，
检测手段简单，可与流动注射等
其他先进技术联用，易实现自动
化，程序化，前景十分广阔。由于
此浊度法具有上述特点，故在分
析科学中有广泛的应用。
2.4
离子色谱法
离子色谱法是比较新的离子
分离技术。这一方法现已广泛应
用于环境监测、盐水、土壤、
血
液、
锅炉水、
乳制品等试样的分
析之中。张新申等[13]
利用自制的
离子色谱仪对制革生产中的浸
酸废液、
铬鞣废液、
总污水中的
氯离子含量进行了测定。表明氯
离子浓度在10
- 5
~10
- 3
mol/L
范围
内有很好的线性关系，测量上限
为10
- 2
mol/L，回收率为98.6%
~102.5%。朱子平[14]
采用萃取分
离法消除乳化液中有机组分对
测定组分的影响及对色谱柱所
造成的污染，应用离子色谱法检
测了乳化液中氯离子。其加标平
均回收率为95%~105%，相对标
准偏差优于4.0%（n=20）。
陆克平
等[15]
采用在碱性条件下加热回流
分解双氧水，用离子色谱法测定
其中微量氯离子。得出双氧水中
氯离子检测限为0.06 g/mL，线性
方程为C=1.155 ×10
- 5
A- 0.
02435。
线性范围为0.10~15.0
g/mL，浓度与面积的相关系数r
=0.9992。
王艳丽等[16]
用高纯Cu
粉与
浓HNO 3
进行氧化还原反应，
170
℃加热分解Cu（NO 3
）2
，去除绝大
部分NO 3
-
，研究了一种以离子色
谱电导检测法测定HNO 3
中微、
痕量级Cl
-
的方法。Cl
-
的加标回
收率为87.5% ~93.7%
，
RSD（n
=5）<10%。刘燕等[17]
采用离子色
谱双柱串联法分离硝酸样品，以
离子色谱电导检测法测定硝酸
滤液中的痕量氯离子。氯离子浓
度在0.01~0.30 mg/L
范围内与色
谱峰面积成线性关系，线性相关
系数r =0.997，对硝酸样品进行
测定，氯离子的加标回收率为
96.5%~99.0%，测定结果的相对
标准偏差为1.84% ~ 2.83%（n
=5）。
宋晓年等[18]
采用预浓缩离子
色谱法（采用浓缩柱预先浓缩样
品然后进来）测定高纯度水中痕
量氯离子，分析结果线性回归后
得出方程为H = 0.429C- 0.596，
式中H
为测得氯离子的峰高；
C
为氯离子含量，线性相关系数r =
0.9985，标准曲线有很好的线性
关系，可监测高纯去离子水中
10
- 9
mg/L
氯离子。
离子色谱法简单方便，灵敏
度高，测量快速而准确，且不需
要其他化学试剂，能快速、
简便、
高效、安全地应用于实际分析，
尤其适用于大批量试剂连续测
定。
2.5
原子吸收法
原子吸收是基于被测物质的
原子蒸气对特定谱线的吸收作
用来进行定量分析的一种方法。
顾永祚等[19]
以Cl
-
与定量Ag
+
生
成AgCl
沉淀反应为基础，提出了
一个测定水中Cl
-
的间接原子吸
收法。Cl
-
浓度在0~50 g/mL
范围
内呈线性。钱初洪等[20]
用原子吸
收法间接测定了己二酸铵中的
微量氯离子，此法通过加入乙醇
和雾化增效剂，使AgCl
的溶解度
降低并提高了原子化效率，从而
使测定的灵敏度提高，利用
AgNO 3
与己二酸铵中的微量氯离
子反应，测定剩余Ag
+
间接求出
氯离子的含量，测定的相对标准
偏差1.9%~4.8%，灵敏度（1%A）
为0.022 mg/L。
叶晓萍[21]
利用乙醇-
明胶可
以提高氯化银沉淀的稳定性，
行业论坛
34
第15
期
AEO- 7
表面活性剂对银原子化
效率也有明显提高的特性，研究
了在一定的介质条件及仪器分
析条件下，通过加入乙醇-
明胶
和AEO- 7，应用石墨炉原子吸收
法测定银离子含量，从而间接测
定高价稀土氧化物矿物中氯离
子的含量，其线性范围为20~100
g/L，相关系数r = 0.9997，
RSD
=0.27% ，加标回收率为92.5%
~102.0%。
杨延等[22]
研究了火焰原子吸
收光谱法间接测定电厂高纯水中
的痕量氯离子的方法。该法采用
AgCl
沉淀，测定剩余Ag
+
间接求
出氯离子含量。方法的相对标准
偏差2.3%~8.6%，加标回收率为
94% ~103% ，灵敏度（1% A）为
0.029 mg/L。袁志莉等[23]
研究了在
酸性环境中，氯离子与银离子生
成沉淀，经氨水溶解后，用火焰原
子吸收法测定银，从而间接测定
出氯离子的含量。本方法测定氯
的线性范围为1.0~30 g/mL，相关
系数r = 0.999，灵敏度为0.023
g/mL
（1%），检测下限为0.059
g/mL，回收率为95%~105%。
王传化[24]
利用原子吸收分光
光度法间接测定了湿法磷酸中
微量氯（0.001%~0.01%）。此法是
用适当过量的Ag
+
与Cl
-
反应，
将生成的沉淀AgCl
过滤后，用原
子吸收分光光度法测定滤液中
剩余的Ag
+
含量，从而得出湿法
磷酸中氯含量。氯离子的线性范
围为0.6~1.0 g/mL，加标回收率
为99.5%~101.1%。
原子吸收法具有较高的灵敏
度、
很好的重现性、
较高的准确
度和操作简单，容易掌握，干扰
少等特点，对微量氯离子的跟踪
监测是科学准确简单易行的。
2.6
流动注射法
流动注射分析（Flow Injection
Analysis，
FIA）是一种容易实现现
场与邻近实验室联线的自动分
析系统，广泛用于环境、
农业、
医
药、
临床、
食品、
冶金、
生物化学
等方面的金属、
非金属和有机物
等的分析。
廖霞等[25]
探讨了用流动注射
-
双波长分光光度法测定水样中
游离氯的最佳化学条件和最佳
仪器参数，选择参比波长为650
nm，测定波长为553 nm
之处进
行比色测定。
此方法的精度
（RSD）和检出限分别为1.2%
（10.88 g/mL，
n =11）和0.24
g/mL，用本系统测定水样中的游
离氯，回收率在100.0%~110.0%
之间，检测限低，线性范围宽，重
视性好，可对自来水及漂白粉游
离氯进行实际应用测试。吕淑清
等[26]
根据氯离子与硫氰酸汞和硝
酸铁在酸性介质中反应生成红
色络合物的吸光度与水中氯离
子的含量成正比这一反应原理，
建立了用流动注射-
分光光度
法测定微量氯离子的自动分析
方法。本方法的检测极限为20
g/L，相对标准偏差为0.89%，回
收率为100%~105%，分析速度为
60~120
样/h，适用于火电厂炉水
中微量氯离子的测定。
王建伟等[27]
以可编程逻辑控
制器来控制系统以实现自动操
作，测定频率达80
次/h，建立了
一种应用流动注射连续快速监
测饮用水中余氯的方法。此方法
的检测下限为0.1 mg/L，线性范
围0.1~1.6 mg/L，相关系数为
0.9980。
FIA
技术具有装置小型简
单，操作可靠，自动化程度高，分
析速度快，分析结果重现性良
好，所需试剂量少，灵敏度高，检
测下限低等优点，可与比浊法、
速差动力学分析等多种分析方
法联用且效果更佳，具有良好的
应用前景。
2.7
容量法
容量法[28]
测定生活饮用水中
的氯离子，有硝酸银容量法（A）
和硝酸汞容量法（B）。A
法为沉
淀滴定法，终点变色不敏锐，易
受氯化银沉淀颜色的干扰，需以
对比法判定终点，带有很大的经
验性。B
法的终点变色很敏锐，易
于判断，但要严格控制试液的pH
值在3.0±0.2
的范围内。若水样
氯离子含量超过100 mg/L
时，须
稀释样品。
张艳[29]
确定了二苯卡巴腙
（DPCO）和二苯碳酰二肼（DPCI）
两种指示剂、
不同酸度对测定结
果的影响，并不经稀释直接测定
了高浓度的样品，测量结果得A
法的回收率为102.2%~101.0%，
RSD<0.016；
B
法的回收率为
100.2%~100.5%，
RSD<0.009。硝
酸汞容量法测定饮用水中的氯
离子，方法简便，终点变色敏锐，
其准确度和精密度均优于硝酸
银容量法，由于水样具有一定的
缓冲能力，对于含量高的样品，
只需将试液滴定前的pH
值控制
在3.2，样品不需稀释可以直接
俞凌云，等：氯离子测定方法及其应用研究行业论坛
35
西部皮革第31
卷
测定。B
法的适应浓度范围广，准
确度、
精密度均优于A
法。其原
因主要是A
法的终点颜色由黄
色变为砖红色，变色不明显，需
以对比法进行终点判定。而B
法
的终点颜色是由微黄色变为淡
紫色，变色敏锐，易于判定。
陆克平[30]
发现现行硝酸汞容
量法测定安庆分公司炼油污水
中氯离子含量大大偏高和终点
变色迟缓返色等现象。于是改进
了炼油装置污水的预处理方式，
将样品经过滤直接加热挥发、
酸
性条件下双氧水消解和碱性条
件下煮沸等过程后，能完全消解
和去除干扰离子，消除该现象，
而且氯离子几乎无损；汞氯配合
物的平均配位数与试液中氯离
子浓度有关，通过控制取样量，
使氯离子浓度在平均配位数近
似为2
的可准确测定范围。改进
后的硝酸汞容量法单次试验分
析周期为40 min，可准确测定至
0.35 mg/L
的氯离子，氯离子回收
率为98.0%~102.4%。
3
其他分析方法
陈建欣[31]
用电化学分析法测
定工业亚磷酸中氯离子含量，应
选择测定环境无氯气存在，参比
电极采用217
型双盐桥饱和甘
汞电极，若用新银电极要先用乙
醇擦洗，用蒸馏水泡24 h，然后
用0.001 mol/L
的AgNO 3
溶液浸
泡20~30 min
将电极活化，用
0.1000 mol/L
的AgNO 3
标准溶
液，试样质量10 g
左右为宜，本
方法适用于可溶性氯化物的测
定，测定最低值可低至0.0001%。
魏红兵等[32]
研究了用自动电
位滴定法测定化肥中氯离子含
量的方法。本方法是先将样品溶
解后加3
倍溶液体积量的乙醇，
然后用硝酸银标准溶液通过自
动电位滴定仪进行等当点滴定。
氯离子的检出下限为0.006，回
收率为98.6%~102.0%。
邵海青[34]
研究了以银电极作指示电极，
217
型甘汞电极作参比电极，在
经冷藏后的铜电解液中加入过
量的硝酸银标准溶液，以氯化钾
标准溶液电位返滴定测定氯离
子含量。
测得回收率在95%
~100%范围内，
RSD=2.8%。电位
滴定法简捷方便，测量准确，工
作效率高。
4
展望
在各种氯离子分析方法中，
以离子色谱法最为简便快速与
通用，而硝酸银容量法和硝酸汞
容量法因不需要特殊的仪器及
器皿简单，在废水的氯离子含量
测定中最为普及。虽然汞量法需
用到有毒试剂，但较银量法溶液
稳定性好、
可消除残硫酸根及低
pH
条件下滴定可减少干扰。但
两种容量法都存在灵敏度低、
重
现性差、
误差大等缺点。分光光
度法以其灵敏度高，选择性好，
操作简单等优点广泛用于各种
微量以及痕量组分的分析。浊度
法快捷简便且运行成本低，易实
现自动化，在分析科学中有广泛
的应用。离子色谱法虽然检测下
限很低，但操作复杂，仪器昂贵，
不适宜于实际生产的应用。原子
吸收法是一种十分成熟的痕量
分析技术，操作简便、
仪器普及、
重现性好、
有较高的灵敏度和选
择性，因此在稀土工业生产及分
析研究工作中得到广泛的应用。
流动注射有检测限低，线性范围
宽，重视性好，可与多种分析方
法联用，以此建立起来的痕量氯
离子浓度自动测定方法，更适合
于发电厂、
化工厂等生产运行中
各种水或中间反应过程中的氯
离子浓度的实时、在线自动监
测。
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西部皮革行业论坛
42
⑵ 请问什么是活性的超氧化物歧化酶，人工是如何制造出来的
超氧化物歧化酶(SOD) 超滤法生产新工艺
前 言
SOD的中文名称是超氧化物歧化酶，其英文名为Superoxide dimutase，分子量(牛血红细胞) 约 32000 是广泛存在生物体内的金属蛋白醇 ， 别名有 ： orgotein，ormetein，ontosein； Cu.Zn-SOD；Palosein等，SOD被科学家誉为21世纪最有发展前途的药用酶。
一、本工艺是从红细胞，肝和其它哺乳动物组织分离而得的金属酶；含两个亚基，每个亚基各含一个铜原子和一个锌原子，SOD可催化O2，歧化为H2O和O2， 其性质不仅仅取决于酶蛋白，而且还取决于活性部位的金属离子，按金属离子类型不同， 可分为Cu.Zn--SOD和Fe--SOD，Mn--SOD三种.在一般条件下，SOD较稳定. 不同来源的 Cu.Zn--SOD，其紫外吸收光谱略有差异，如牛血SOD在258nm处显示最大吸收，而猪血SOD的最大吸收峰为265nm，在特定条件下，酶的活性可下降，甚至完全丧失， 如氰化物可抑制SOD活性，双氧水使SOD活性下降，氯化胍能明显抑制SOD活性等。
二、SOD用途主要是基于SOD是超氧阴离子清除剂，超氧阴离子(O2~)是人体内有毒物质，它能引起多种疾病，故能清除炎症过程中伴同产生的超氧离子， 而显示出强大的抗炎作用。
在医药工业：SOD可以治疗由于超氧离子引起的各种疾病，如糖尿病，白内障， 风湿性关节炎等，也是消炎的有效药物，而且还能抗衰老，抗肿瘤，抗辐射， 抗自身免疫疾病，现代研究表明态仔：SOD还能治高血压，冠心病，胆囊炎，肺气肿等难治之症. 日用化学工业：由于SOD有防止细胞老化和解毒等功效， 因此在化妆品和护肤剂等工业产品中，添加SOD之后，具有防晒，祛斑，使皮肤柔嫩的作用.是目前化妆品行业中不可缺少的一种添加剂，国内及同行都已出现大量产品.食品工业：在食品添加剂加 SOD之后，增强营养，解除毒性，延长体内细胞寿命，国内已有SOD营养液产品， 并通过上海科研单帆悉汪位有关专家的鉴定。
三、SOD的开发前景：目前SOD在全国仅有少数科研单位及生化制药厂研究和开发本产品，而使用SOD产品厂家却日益增多，远不能满足市场需求 . 为鼓励和大力开发SOD新产品，国家已将其列入重点科技开发项目，并投放大批经费，现已获得成功， 开始向企业化生产转移，市场前景十分广阔。
四、注意事项：(1)我中心热忱欢迎社会各界朋友现场学习，由生化工程师向您授课，通过现场操作，指导，培训，使您尽快掌握该技术。(2)本工艺， 技术资料等不经我公司同意，不得擅自转让，翻印，销售给任何单位和个人，违者法律追究。
新法提炼技术
一、主要设备：(1)工业用离心机一台；(2)恒温水浴锅(10L--50L)(可自制)1台；(3)冰柜1台；(4)搅拌机1台；(5)玻璃器皿：1000ml，500ml烧杯各3只，50ml烧杯 2 只，50ml，500ml量杯各1个；(6)塑料桶若干个。
二、主要试剂：(工业纯度)柠檬酸钠，柠檬酸，葡萄糖，乙醇90%，氯仿，丙酮，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，去离子水或蒸馏水，葡萄糖凝酸胶SephadexG-- 100 和DEAE--纤维素.
三、试剂的配制：
1.抗凝剂配方：(1)柠檬酸钠30g，柠檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升，一般此种是每7ml血液，加1ml(抗凝剂).(2)40g/升柠檬酸钠溶液：在1升水中加入0.9克的氯化钠。
2.生理盐水：(0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化钠。
3.磷酸盐缓冲溶液的配制：PH7.6，0.2M磷酸盐缓冲溶液，一般用Na2HPO4.H2O，35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升，前者加87.0ml，后者加13.0ml混合后即为PH=7.6 缓冲溶液，如果用K2HPO4.3H2O为45.644g/升，NaH2PO4.2H2O为31.21克/升，仍是前者87.0ml，后者13.0ml混合后即得。
4.冷却剂：在本工艺中有使用-15度低温，一般用如下配方：用33克食盐加入100克雪或碎冰，以此比例配成混合体可达-21.3度。
四、工艺流程
(一)除血红陆配蛋白
1.血液抗凝处理，在新鲜牛、马、猪血中迅速加入ACD1号抗凝剂，并缓慢搅匀，每7毫升血液中加入抗凝剂1毫升或2号抗凝剂。
2.把抗凝处理的血液放入离心机，以3000r/min离心约15--20分钟， 用吸管把上清液(黄色血清)小心吸去抛掉，下层的红血球用2--3倍生理盐水洗2--3次，在每一次洗涤中，用离心机以3000r/min离心，7--8分钟，反复操作后，得到洗涤血红细胞，洗涤后的血红细胞在-15度下冷冻可保存半年并不影响产率和比活，在血液量大， 处理不完时必须这样做。
3.在洗净的红血球中加入等体积去离子水，剧烈搅拌30分钟，使红血球细胞壁砍碎，以使其内的SOD浸出.最好在0--4度静止过夜后，把溶血进行有机提取。
4.接着向溶血中缓缓加入0.2--0.25倍体积的预冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍预冷氯仿，搅拌10--15分钟后，原溶血呈浆糊状，静止1--2小时，用滤布除去凝固的血红蛋白，然后将滤液2500r/min离心约1--5分钟留上清液抛去沉淀， 此时如果上清液略为微黄色时，可用快速过滤纸过滤，可得到微带蓝色的清澈透明的粗酶液。
(二)粗酶液的初步提纯：
1.丙酮提醇：向酶液中加0.8倍量预冷(-15度 ) 丙酮 ， 生成大量白色沉淀 ， 以3000r/min离心2分钟收集沉淀，上清液可不必吸取，直接倾倒。
2.热变性：(除杂蛋白)准备好衡温浴锅，在本工艺中，提前30分钟， 注满水接通电源后，使之加热到55--60度以省时间，将沉淀量约50倍量体积比加入0.2MPH=7.6磷酸钠缓冲溶液，水浴加热至60度，15分钟后迅速冷却到室温.3000r/min离心2 分钟得上清液，在上清液中，缓缓滴加0.6倍体积的预冷(-15度)丙酮，生成白色沉淀。
3.初纯SOD：在上述沉淀中加去离子水，制成20--30%SOD溶液，分装入样品瓶中，放入冷冻干燥机中，于开机后以0.2--0.1Torr真空度，约1.5--2小时， 得到化妆或食品用SOD，该产品比活大于3000u/mg，外观呈微带蓝色的白色冻干品。
(三)SOD进一步提纯：
SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析，柱层析后的SOD没有小分子等杂质， 层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高，它主要作为生物化学试剂， 化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种，二者可单独使用，也可结合使用，一般是DEAE-- 纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析，将(二)2，热变性后SOD丙酮沉淀用PH7.6，0.2MNaH2PO4-NaHPO4缓冲溶液溶解，有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀，上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或2.5*30cm)，梯度洗脱 ， 洗脱液为PH7.6，0.2M，NaH2PO4--NaHPO4缓冲液，下流速度控制在0.2--0.5ml/min，在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液，合并活力峰，再用蒸馏水反复透析，透析彻底后， 放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品。
五、注意事项：
1.掌握适当的温度和时间：虽然SOD对热较稳定， 但在分离纯化过程中最好还是采用较低温度，一般以0--10度为宜，时间长不要超过3天。
2.注意提取，提纯方法：使用有机溶剂或者加热均能有效沉淀蛋白质， 但掌握适当溶剂和加热结合的办法可以达到最佳效果。
六、SOD的检测方法：活性检验，比较方便的办法是用连笨三酚自氧化法， 先测得连笨三酚的自氧化速率，然后加入SOD再测得加入SOD之后的氧化速率，按照酶活性单位定义，即在最佳条件下，每分钟抑制连笨三酚自氧化分解速率达50% 的酶量定义为一个酶单位.依次求出活力总值 ，同时也可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定其纯度，看其分子量32000左右的一条带是否与有关文献指导一致.
超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 简称SOD)是一种重要的氧自由基清除剂，作为一种药用酶，引起国内外生化届和医药届的极大关注。SOD应用于医学临床上可以治疗多种疾病，类风湿性关节炎、心肌梗塞等，在防辐射，抗衰老，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品和食品添加剂的行列。
自1969年Mccord和Fridovich 首次发现从牛血细胞中发现超氧化物岐化以来，到目前为止，国内已有几十家科研单位对SOD作了大量的研究和试产工作，而且有些已批量生产。SOD引起了国内生化界的重视，1988年在浙江宁波如开了《全国首届SOD学术会议》。1989年4月在河南开封《第三届药用酶学术会议》上，SOD被列为重点开发项目，90年7月在大连《全国第二届SOD学术会议》，SOD已作为一种药用酶发展较快，将成为一种很有前途的生化产物。
SOD是一种广泛存于动物、植物和微生物的生物酶，国外药用SOD系从血中提取，国内SOD已开发的品种已超过20种，证明我国对SOD的研究和应用已进入新时期。
我国从牛、马、猪、鸡、狗等动物血中提取SOD来源丰富，成本低，提取和纯化较方便，药细胞膜易破，用常规分离纯化法可获得高纯度的SOD。
本技术采用热变性，超滤新技术，不仅大大简化了工艺过程，而且产品质量和收率都比老工艺有较大的提高，其提取的SOD均为CuZu-SOD。
一、药品与仪器：
(1)柠檬酸三钠：Na3C6H6O7 (2)工业丙酮CaH6O
(3)邻苯本酚 (4)酸磷钾K3Poe4
(5)弱碱性阴离子交换剂DEAE Sephadsxa-50外观40-120ubrd或者DEAE-cell-ujose(DE-32)二乙基纤维素。 (6)冷冻干燥器(自己组配)
(7)层折柱(7.5＊30cm) (8)离心机
以上试剂及其它药剂、仪器可在各省市化学试剂商店、医疗器械商店购买。
二、Cu、Zu-SOD的提取及纯化(牛、马血为例)
1、工业流程：
加抗凝剂 盐洗
鲜牛血--------------------->红血球------------------------>
离心除黄色血浆 加NaCL
热变性1 热变性2
压积红细胞-------------->淡黄色混合液--------------------->
68度30分钟 60-65度20分钟
加丙酮 加丙酮 层析
浅蓝色清液----------->絮状沉淀-------------->沉淀------------>
冻干
透析除盐
洗脱----------------->透析液--------->SOD(冻干品)
2、提取方法
(1)收集红细胞：鲜牛血100升，加入3. 8％柠檬酸三钠抗凝剂搅拌均匀，静置，使红细胞自然沉降，除去上层大部分血浆，下层液再离心除尽其余血浆，再加入3倍量0.9％氯化钠(精制食盐)洗涤两次， 离心可收集到压积红细胞(40升)。
(2)热变性1：收集的红细胞再加入4公斤氯化钠，40克氯化铜，蒸馏水100升搅匀，水浴加热到68度恒温30分钟，迅速冷却加至室温，过滤除沉淀，收集滤液。
(3)热变性2：滤液在65度恒温水浴下，向滤液中慢慢中入40克氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温20分钟，迅速冷却至室温，离心去沉淀得上清液。
(4)SOD粗品：超滤心清液加入0.75倍全积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀于离于水，离心除去不溶物得清液，清液加入0.75倍体积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀，沉淀经无水丙酮洗涤脱水两次，真空干燥得淡蓝色粉末状SOD粗品
(5)SOD粗品提纯：SOD粗品溶于2.5mmol/L，PH值7.6磷酸钾缓冲液，将该混合液上在7.5＊30cm的层柱上，离子换剂为DEAE-SphadexA-50(该柱事先用缓冲平衡)，以100～200ml/小时速度上样，完毕后用同一缓冲A280mm值，低于0.02然后用25～200mmol/L，PH值7.6磷酸钾缓冲液进行直线梯度分段洗脱，流速为100ml/小时。用部分收集器收集， 洗脱液经透析除盐后，得浓缩的透析液，经冷冻干燥，得SOD成品，(呈浅绿色)。
三、SOD活性测定：
SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器
(1)邻苯本酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：
(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：
测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
0.0700－A325mm/min
----------------------------------------＊100％度
0.70
样液稀释倍数 样液稀释倍数
酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------
50％ 样液体积
3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：
SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：
单位活力(u/ml) 总活力
比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白
蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白
四、Cu、Zn－SOD性质：
1、Cu、Z n－SOD呈蓝绿色，分子量在3200左右，由两个中一个Cu和一个Zn。
2、对热稳定，天然牛血SOD，75度下加热数分钟其酶活丧失很小。
3、PH值对SOD的影响，SOD在PH5.3～10.5范围内，其催化速度不受影响，PH3.6时SODZn脱落95％，PH12SOD构象发生不可递的构象，导致酶活性丧失。
4、SOD的紫外线吸收特征：SOD在280mm处没有吸收高峰。
5、金属辅其与酶活性。SOD属金属酶Zn仅于分子结构有关，而Cu与催化活性有关。
6、SOD是其具有还有和失活作用的。
五、药品与仪器：
柠檬三钠，分析纯：江苏花桥北工四厂；
工业丙酮：上海溶剂厂；
邻苯三酚，分析纯：贵州遵义化工厂；
六、SOD的包销单位：
(1)河南郑州国营圣科研究所郑州南阳路14号 邮编：450053《河南科技报》91年10月3日
(2)四川省金堂县工艺制品技校生化科接待室：金堂准口执行的院内，政府办公大楼1楼 邮编：610404 联系人：邓勇 彭丽 《四川农村报》 91年3月1日
(3)广东省深圳市上步区石夏东二苍14号科技所 邮编：518031联系人：黄秋林 《科技消息报》92年7月10日
说明：1、资料后附的产品销售地址信息均为我们从近两年的报刊上摘录的各单位广告，并注明有出处。
2、你先看完资料后，行根据自己的实际情况，先小量试验， 并事先联系好产品的收购单位，待取得经验后再批量生产。
3、读者在联系收购单位时，请一定事先去联系，并附上邮资， 待得到明确答复后再根据情况去人办理，千万不要冒然前往，以免造成不必要的经济负担。
4、原料及仪器各地经营原料店供应，广州市人民南路，上九路等地均有供应。
附：详细SOD收购信息
1、广西南宁市生物化学制药厂
地址：鲁班路1号
2、上海生物化学制药厂
地址：海主路513号
3、江苏徐州市生物化学药厂
地址：海沛路86号
4、山东兖州市生物化学制药厂
地址：肉联厂内
5、湖南常德生物化学制药厂
地址：肉联厂内
6、佛山市生物化学制药厂
地址：佛山市
7、广州市明兴制药厂
地址：广州市河南路工业大道北48号
8、广州市白云制药厂
地址：从广州越绣公园坐21路车到三元里北展下车沿着矿泉别墅侧入200米
9、哈尔滨生化药厂哈肉联厂
地址：哈尔滨道外南极街12号院；电话：88423转制药厂
10、沈阳市生物化学制药厂
地址：哈尔滨皇姑区明廉路2号；
11、江苏省南京生物制药厂
地址：江苏省南京市下关区宝塔桥附近；
12、浙江省金华生物化学制药厂
地址：浙江省金华市河盘桥路51号
13、广东生物制药厂
地址：广州市三元里
14、广东汕头市生物化学制药厂
地址：湖山路西巷3号2号；电话：666124
11、江苏省南京生物制药厂
地址：江苏省南京市下关区宝塔桥附近
12、浙江省金华生物化学制药厂
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13、广东生物制药厂
地址：广州市三元里
14、广东汕头市生物化学制药厂
地址：湖山路西巷3号15.上海霞飞日用化工厂
16.北京丽源日用化工厂
17.南京化妆品厂
18.上海日用化学品二厂
19广州美容化妆品厂
20南京第二药物化学制药厂
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广州化妆品厂
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天津市津乐制药厂
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苏州市昊县生物化学厂
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北京日用化学品四厂
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湖北沙市生化制药厂
北京市三露厂
注各大制药厂化妆品厂美容院均为销售对象
电话：010-68150495，68212139
传真：010-68212015
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